ICS 65.120 B46 T/SHAAV 团 体 标 准 T/SHAAV 006 —2021 微生物饲料添加剂中粪肠球菌的测定 Determination of Enterococcus Faecalis in microbial feed additives 2021-04-08发布 2021-04-08实施 上海市畜牧兽医学会 发布 全国团体标准信息平台 全国团体标准信息平台 T/SHAAV 006 —2021 I 前言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由 上海市畜牧 兽医学会 提出并归口。 本文件起草单位： 上海市动物疫病预防控制中心 、上海市金山区动物 疫病预防控制中心、 上海市松 江区食用农产品安全监督检测中心 。 本文件主要起草人： 姜芹、张文刚、孙冰清、顾欣、黄士新、商军、 曹莹、张妤、卢春光、 金一春、 李守富、潘旭东、曹向英、许柯 。 本文件首批承诺执行 单位名单：上海市动物疫病预防控制中心、 上海市金山区动物 疫病预防控制中 心、上海市松江区 食用农产品安全监督检测中心、上海国龙生物科技有限公司、上海欧耐施 生物技术有 限公司。 全国团体标准信息平台 全国团体标准信息平台 T/SHAAV 006—2021 1 微生物饲料添加剂中粪肠球菌的测定 1 范围 本文件规定了微生物饲料添加剂中粪肠球菌的菌种 鉴定和活菌计数方法。 本文件适用于含有粪肠球菌的单一或复合型饲料添加剂中粪肠球菌的测定。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日 期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室生物安全通用要求 GB/T 20195 动物饲料 试样的制备 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 微生物饲料添加剂 microbial feed additive s 允许在饲料中添加或直接饲喂给动物的 ，具有促进动物健康、或促进动物生长、或提高饲料转化率 等功能的 微生物制剂。 4 试剂或材料 4.1 要求 除另有规定外 ，所有试剂 仅为分析纯，水为符合 GB/T 6682 规定的三级 水，试剂或培养基按附录配 制或用商品化产品。 4.2 试剂 4.2.1 灭菌生理盐水： 称取8.5 g氯化钠， 加入适量水溶解后，定容至 1000 mL，在121℃灭菌15 min。 4.2.2 革兰氏染色液：按 照附录A的A.1执行。 4.2.3 细菌生化鉴定试剂盒。 4.2.4 2×Premix Type ：含Taq DNA聚合酶、限制性内切酶、 dNTPs、Mg2+等（适用于 TaqmanqPCR 方法） 。 4.2.5 引物和探针：上 游引物：5’-CCAGCATTTGGTGCCATAATT -3’；下游引物： 5’-AGATATCCGTACTGCCGTTCG T-3’；探针： 5’-FAM-TTTGCGTGACCGCCACCATTGT -BHQ1-3’。 4.3 培养基 4.3.1 胆汁七叶苷叠氮钠琼脂培养基 ：按照附录 A的A.2执行。 4.3.2 胰酪大豆胨琼脂培养基（ TSA）：按照附录 A的A.3执行。 4.4 标准菌株 粪肠球菌： ATCC 29212 或BNCC 186300 。 4.5 材料 全国团体标准信息平台 T/SHAAV 006 —2021 2 4.5.1 无菌培养 皿：直径90 mm。 4.5.2 接种环： 1 μL。 4.5.3 无菌离心管： 1.5 mL，15 mL。 4.5.4 无菌锥形瓶： 500 mL，或无菌均质袋。 5 仪器设备 5.1 恒温培养箱： 36℃±1℃。 5.2 冰箱：-20℃，0℃～4℃。 5.3 离心机： ≥12 000 r/min 。 5.4 天平：感量0.01 g。 5.5 微量移液器： 10 µL，100 µL，1 000 µL。 5.6 移液器：10 mL。 5.7 显微镜： 40倍～1 000倍，精度0.05 µm。 5.8 pH计或精密pH试纸：测量范围 pH 0～14，精度0.1 pH单位。 5.9 二级生物安全柜或超净工作台。 5.10 恒温水浴锅。 5.11 振荡器。 5.12 微生物生化鉴定仪。 5.13 实时荧光定量 PCR仪。 6 试样制备 试样制备按照 GB/T 20195 执行，样品制备后应尽快检测。 7 测定流程 微生物饲料添加剂中粪肠球菌的测定流程见图 1。 全国团体标准信息平台 T/SHAAV 006 —2021 3 试样25 g（或25 mL）+225 mL灭菌生理盐水 10倍梯度稀释 选择3个连续适宜稀释度的试样匀液 ，各取1 mL加入无菌培养皿中 培养皿内倾注 15 mL～20 mL胆汁七叶苷叠氮钠琼脂培养基 挑取3个或以上可疑菌落 形态观察 生化或荧光定量 PCR鉴定菌落计数 计算并报告36 ±1 培养20 h±2 h 图1 微生物饲料添 加剂中粪肠球 菌测定流程图 8 活菌计数 8.1 试样稀释 以无菌操作称取充分混匀的试样 25 g (或25 mL)，加入225 mL灭菌生理盐水中，制成 1:10的稀释液。 置振荡器中，振荡 2 min～3 min，至均匀。取 1 mL 1:10的试样匀液，加入 9 mL灭菌生理盐水中，制成 1:100的试样匀液。根据 样品标示含菌量进行系列 10倍梯度稀释。 8.2 接种培养 根据待检样品标示含菌量对试样实际含菌量进行 估计，选择3个连续的 适宜稀释度的试样匀液。分 别取1 mL加入无菌培养皿中，加入 15 mL～20 mL冷却至46 ℃±1 ℃的胆汁七叶苷叠氮钠琼脂培养基， 每个稀释度做 2个重复。同时以 1 mL灭菌生理盐水作空白对照。小心转动充分混匀，待培养基凝固后， 36 ℃±1 ℃倒置培养 20 h±2 h。 示例： 当样品标示含菌量≥108 CFU/g，选择10-5、10-6、10-73个稀释度进行接种培养。 8.3 菌落计数 8.3.1 选取特征菌落数 在30 CFU～300 CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于 30 CFU 的平板记录具体菌落数 ，大于300 CFU的可记录为多不可计 。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平 均数。 全国团体标准信息平台 T/SHAAV 006 —2021 4 8.3.2 其中一个平板有较大片状菌落生长时 ，则不宜采用 ，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释 度的菌落数 ；若片状菌落不到平板的一半 ，而其余一半中菌落分布又很均匀 ，即可计算半个平板后乘以 2，代表一个平板菌落数。 8.3.3 当平板上出现菌落间 无明显界线的链状生长时 ，则将每条链作为一个菌落计数 。 9 鉴定 9.1 菌落挑选和纯培养 随机挑选胆汁七叶苷叠氮钠琼脂平板 上3个或以上呈灰褐色至黑色、圆形、凸起、表面光滑 、边缘 整齐、直径约为 1 mm的菌落分别 划线接种于 TSA平板上， 36 ℃±1 ℃倒置培养 24 h±2 h，刮取菌苔进 行形态观察和 菌株鉴定。 9.2 形态观察 革兰氏染色 ,镜检。粪肠球菌 为革兰氏染色阳性 球菌，呈圆形或椭圆形 ，直径0.5 μm～1.0 μm，单 个，多成双或短链状排列，无芽孢。 9.3 菌株鉴定 9.3.1 方法选择 9.3.2与9.3.3任选其一。 9.3.2 生化鉴定 使用细菌生化鉴定试剂盒进行 生化鉴定，或可采用微生物生化鉴定仪 进行生化鉴定 。同时设阴性对 照（空白）和阳性对照（ ATCC 29212 或BNCC 186300 ）。粪肠球菌可发酵葡萄糖、半乳糖、麦芽糖；不 发酵赤藓糖醇、 L-阿拉伯糖；产精氨酸双水解酶；不产过氧化氢酶、β -半乳糖苷酶。粪肠球菌典型生 化鉴定特征 见表1。 表1 粪肠球菌典型生化鉴定特征 项目 结果 葡萄糖 + 半乳糖 + 麦芽糖 + 赤藓糖醇 — L-阿拉伯糖 — 精氨酸双水解酶 + 过氧化氢酶 — β-半乳糖苷酶（ ONPG） — 注1：“+”为阳性反应，“ -”为阴性反应。 注2：屎肠球菌的 L-阿拉伯糖和 ONPG反应结果为阳性。 9.3.3 荧光定量 PCR鉴定 9.3.3.1 DNA模板制备 取9.1中菌苔适量，加入含 200 µL双蒸水的离心管中，混合均匀。 95 ℃加热10 min，冻融一次， 12 000 r/min 离心2 min，取上清为模板。同时设阴性对照（双蒸水）和阳性对照（ ATCC 29212 或BNCC 186300）。 全国团体标准信息平台 T/SHAAV 006 —2021 5 9.3.3.2 荧光定量 PCR扩增 荧光定量 PCR扩增体系如下： —— 反应体系： 2×Premix Type 10 µL、DNA模板2 µL、上、下游引物及探针各 1 μL（10 µmol/L）、 双蒸水5