ICS65.020.30 B43 团体标准 T/SDAA019－2021 禽源细菌药物敏感性试验技术规程 Codeofpracticeforantimicrobialdrugsusceptibilitytestsfor bacteriaisolatedfrompoultry 2021－06－22发布 2021－07－23实施 山东省畜牧协会发布 全国团体标准信息平台 2T/SDAA019-2021 全国团体标准信息平台 3T/SDAA019-2021 前言 本标准按照GB/T1.1-2020给出的规则起草。 本标准由山东省畜牧协会提出并归口。 本文件起草单位：中国农业科学院饲料研究所、山东益生种畜禽股份有限公司、青岛农业大 学。 本文件主要起草人：徐飞、陈孝杰、张靖菊、刘静、郭龙宗、尹燕博、张向阳。 本文件为首次发布。 全国团体标准信息平台 4T/SDAA019-2021 全国团体标准信息平台 5T/SDAA019-2021 禽源细菌药物敏感性试验技术规程 1范围 本文件提供了禽源细菌的抗菌药物敏感性试验技术规程。 本文件适用于养殖场禽源大肠杆菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌的抗菌药物体外敏感性试 验。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期 的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括 所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 中华人民共和国兽药典（2020版） 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 敏感Susceptible；S 当抗菌药物对分离株的MIC值或抑菌圈直径处于敏感范围时，使用推荐剂量进行治疗， 该药在感染部位通常达到的浓度可抑制被测菌的生长，临床治疗可能有效。 3.2 中介Intermediate；I 当菌株的MIC值或抑菌圈直径处于中介时，该数值接近药物在血液和组织中达到的浓度， 从而治疗反应率低于敏感菌群。 3.3 耐药Resistant；R 当抗菌药物对分离株的MIC值或抑菌圈直径处于该分类范围时，使用常规治疗方案，该 药在感染部位所达到的药物浓度不能抑制细菌的生长，和（或）被测菌株获得特殊耐药机制， 且治疗性研究显示该药临床疗效不确切。 4试剂和材料 全国团体标准信息平台 6T/SDAA019-2021 4.1培养基 4.1.1Mueller-Hinton琼脂培养基：配置方法见附录A.1。 4.1.2普通肉汤培养基：配置方法见附录A.2。 4.2质控菌株 大肠杆菌Escherichiacoli ATCC®25922 金黄色葡萄球菌StaphylococcusaureusATCC®25923 -20℃以下保存。 4.3药敏纸片 -20℃条件下密封干燥处贮藏。 5仪器设备 5.1冰箱：-40℃、-20℃、2℃～8℃。 5.2恒温培养箱：36℃±1℃。 5.3超净工作台。 5.4恒温摇床培养箱：36℃±1℃。 5.5高压灭菌锅：103.4Kpa、121.3℃。 5.6麦氏比浊管：0.5号。 5.8微量移液器：0.5μL~10μL、10μL~200μL、100μL~1000μL。 5.9灭菌试管：Φ13×100mm。 5.10无菌培养皿：Φ100mm、Φ150mm。 5.11游标卡尺：精度0.05mm。 6药敏试验步骤 试验步骤详见图1所示。 全国团体标准信息平台 7T/SDAA019-2021 图1抗菌药物敏感性试验步骤流程图 7操作步骤 7.1药敏纸片准备 根据细菌种类选择合适的商品化药敏纸片，参考依据见附录B.2~B.4。 将药敏纸片从冰箱中拿出，室温放置1h~2h再进行使用。测抑菌环直径接种平板放置药敏纸片増菌（见7.2） 判断质控情况准备待检菌 药敏纸片（见4.3） 标准菌悬液（见7.2） 不在质控范围结果判定 （参考附录B） 报告在质控范围孵育（见7.5） 全国团体标准信息平台 8T/SDAA019-2021 7.2菌悬液制备 7.2.1増菌 用无菌接种环在琼脂培养基上挑取至少4~5个分离良好、形态相似的单克隆菌落，分别 接种到含有2mL~3mL普通肉汤培养基的试管中增菌。 肉汤培养物在200r/min、36℃±1℃的恒温摇床中培养2h~6h直至其到达或超过0.5 号麦氏比浊管的混浊标准（见5.9）。 7.2.2标准菌悬液 用无菌生理盐水或肉汤调节菌悬液的混浊度，使其达到0.5麦氏浊度标准，此时菌悬液 浓度约为1.5×108CFU/mL。 7.3平板接种 菌悬液制备后15min内，用无菌棉棒蘸取菌悬液，并在试管内壁挤压，去除棉棒上多 余的液体。接种时用棉棒在整个无菌Mueller-Hinton琼脂表面划线，重复此次操作两次以上， 每次旋转培养皿大约60°，以保证接种物的分布均匀，最终的抑菌圈为统一圆形。 7.4药敏纸片放置 放置合适的药敏纸片于琼脂表面。用消毒的镊子或是针尖轻轻压，确保其与琼脂表面完 全接触。各纸片间中心距离>24mm。一个150mm的培养皿上不超过12个纸片，或100mm 的培养皿上不超过5个纸片。 7.5孵育 平板放置药敏纸片15min内，于36℃±1℃的培养箱中倒置孵育16h~18h。 7.6抑菌圈测量 用游标卡尺在黑色、不反光背景下测量抑菌圈直径。 7.7结果判定 判定标准参见附录B。 若质控菌株不在质控范围内则需要重新试验。 全国团体标准信息平台 9T/SDAA019-2021 附录A （规范性） 培养基和试剂 A.1Mueller-Hinton琼脂基础培养基 A.1.1成分 牛肉粉 6.0g 可溶性淀粉 1.5g 酸水解酪蛋白 17.5g 琼脂 17.0g 水 1000mL A.1.2配制 取基础培养基成分，加热溶解于1000mL蒸馏水中，调节pH值至7.3±0.1；或取商品 化培养基，按说明书进行配制。配制好培养基于121℃高压灭菌15分钟，冷至50℃，倾入 无菌平皿，备用。于4℃条件保存，有效期7天。 A.2普通肉汤培养基 A.2.1成分 蛋白胨 20g 牛肉膏 5g 氯化钠 5g 水 1000mL A.2.2配制 称取基础培养基成分或商品化培养基，加入蒸馏水或去离子水1000mL，搅拌加热煮沸 至完全溶解，调节pH值至7.5±0.2后分装试管。将试管放入灭菌锅中，121℃高压灭菌20min， 冷却至室温，备用。 全国团体标准信息平台 10T/SDAA019-2021 附录A （规范性） 培养基和试剂 A.1Mueller-Hinton琼脂基础培养基 A.1.1成分 牛肉粉 6.0g 可溶性淀粉 1.5g 酸水解酪蛋白 17.5g 琼脂 17.0g 水 1000mL A.1.2配制 取基础培养基成分，加热溶解于1000mL蒸馏水中，调节pH值至7.3±0.1；或取商品 化培养基，按说明书进行配制。配制好培养基于121℃高压灭菌15分钟，冷至50℃，倾入 无菌平皿，备用。于4℃条件保存，有效期7天。 A.2普通肉汤培养基 A.2.1成分 蛋白胨 20g 牛肉膏 5g 氯化钠 5g 水 1000mL A.2.2配制 称取基础培养基成分或商品化培养基，加入蒸馏水或去离子水1000mL，搅拌加热煮沸 至完全溶解，调节pH值至7.5±0.2后分装试管。将试管放入灭菌锅中，121℃高压灭菌20min， 冷却至室温，备用。 全国团体标准信息平台