(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211144520.0 (22)申请日 2022.09.20 (71)申请人 浙江大学 地址 310000 浙江省杭州市西湖区余杭塘 路866号 (72)发明人 常圣海　张兴　武灵云　董浩浩　 (74)专利代理 机构 杭州橙知果专利代理事务所 (特殊普通 合伙) 33261 专利代理师 范琪美 (51)Int.Cl. G01N 23/04(2018.01) G01N 1/42(2006.01) G01N 1/28(2006.01) (54)发明名称 高通量冷冻电镜数据收集 新方法 (57)摘要 本发明申请提供了一种高通量冷冻电镜数 据收集新方法： 样品台移动到目标位置后， 通过 两次反向移动样品台， 缩短样品台的稳定时间， 提高冷冻电镜的收集速度。 优化后样品台移动的 详细步骤如下： 样品台常规移动到需要拍照的位 置； 第一次反向移动0.1μm， 在上一步骤的基础 上再反向移动0.02 ‑0.08μm， 然后稳定2s。 权利要求书1页 说明书3页 附图1页 CN 115541627 A 2022.12.30 CN 115541627 A 1.一种高通 量冷冻电镜数据收集 新方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： 1)冷冻样品的制备 2)数据收集 使用冷冻电镜配合自动收集软件进行 数据收集； 3)样品台移动方式 样品台移动的方式由自动收集软件控制， 移动方式采用： 常规移动后反向移动0.1μm， 再反向移动0.02 ‑0.08 μm， 然后稳定2s； 4)使用软件 对收集得到的数据进行漂移矫 正,统计偏移量。 2.根据权利要求1所述高通 量冷冻电镜数据收集 新方法， 其特 征在于， 步骤1具体为： 1.1)载网准备 载网的型号 为Au 1.2/1.3 300目， 然后使用等离 子清洗仪对该载网进行等离 子清洗； 1.2)蛋白样品准备 使用表达纯化得到的膜蛋白L olCDE复合体作为测试样品， 该蛋白浓度为2mg/ml； 1.3)样品制备 取3ul蛋白滴加到处理后的载网上， 使用Vitrobot进行样品制备， 制备条件： 温度为20 ℃， 相对湿度为10 0％， blot force为0， bl ot time为3s。 3.根据权利要求1所述高通量冷冻电镜数据收集新方法， 其特征在于， 步骤2中数据收 集的相关参数设置如下： 名义放大倍数为29000倍， 曝光时间为6.4s， 5帧每秒， 总电子剂量 为 4.根据权利要求1所述高通量冷冻电镜数据收集新方法， 其特征在于， 步骤3为： 样品台 移动的方式由自动收集软件控制， 移动方式采用： 常规移动后反向移动0.1μm， 再反向移动 0.02 μm， 然后稳定2s。 5.根据权利要求1所述高通量冷冻电镜数据收集新方法， 其特征在于， 步骤4为： 使用 Motioncor2软件对收集得到的数据进行漂移矫 正。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115541627 A 2高通量冷冻电镜数据收集新 方法 技术领域 [0001]本发明涉及一种高通 量冷冻电镜数据收集 新方法。 背景技术 [0002]冷冻电镜单颗粒三维重构技术是获取生物大分子高分辨三维结构的重要手段。 单 颗粒三维重构技术需要使用冷冻电镜获取同一均质样品足够多的高质量照 片。 然而现阶段 有限的冷冻电镜机时与日益增加的用户需求之 间的矛盾愈发凸显， 所以不断提高冷冻电镜 数据采集速度和数据质量是 大多数冷冻电镜平台关注的两个核心问题。 [0003]在冷冻电镜数据收集过程中， 需要不断重复的使成像目标移动到束斑中心位置进 行成像。 传统方式是移动电镜的样品台来完成这一过程。 样品台的移动是通过机械齿轮传 导过程完成的， 所以样品台移动到目标位置后， 齿轮会有一个张力导致样品台产生一个固 有的漂移状态。 为了获取高质量的数据， 样品台移动后在获取图像前需要样品台稳定一段 时间， 释放张力， 提高样品成像质量。 稳定时间一般在8 ‑20s， 占取30 ‑40％左右的数据收集 时间， 这是数据收集速度的一个限速步骤。 使用配备K2相机(Gatan)的Titan  Krios G2(赛 默飞)， 通过 该方法， 冷冻电镜的收集速度为每小时6 0张左右。 [0004]除了移动样品台， 也可以通过束斑平移获取成像目标的照片。 束斑平移的原理是， 改变磁透镜线圈电流偏转电子束到目标区域， 对目标区域进行成像。 束斑平移可以节约样 品台移动和样品台稳定的时间， 提高数据的收集速度。 然而， 束斑平移会导致收集的数据产 生额外的像差， 在不进行额外矫 正的情况 下会导致三维重构的分辨 率降低。 [0005]现有技术的主要缺陷在于： 使用移动样品台的方法， 样品台稳定的时间长， 数据收 集速度慢； 使用束斑平 移的方法， 数据收集速度快， 但是会引入额外的像差 。 发明内容 [0006]为了解决背景技术中的技术问题， 本申请的提供一种高通量冷冻电镜数据收集新 方法， 以实现样品台移动到目标位置后， 通过两次反向移动样品台， 使样品台稳定的时间缩 短， 提高冷冻电镜的收集速度的效果。 [0007]本申请的目的是通过以下技 术方案实现的： [0008]一种高通 量冷冻电镜数据收集 新方法， 包括以下步骤： [0009]1)冷冻样品的制备 [0010]2)数据收集 [0011]使用冷冻电镜配合自动收集软件进行 数据收集； [0012]3)样品台移动方式 [0013]样品台移动的方式由自动收集软件控制， 移动方式采用： 常规移动后反向移动0.1 μm， 再反向移动0.02 ‑0.08 μm， 然后稳定2s； [0014]4)使用软件 对收集得到的数据进行漂移矫 正。 [0015]步骤1具体为：说　明　书 1/3 页 3 CN 115541627 A 3