(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211005491.X (22)申请日 2022.08.22 (71)申请人 浙江大学 地址 310058 浙江省杭州市西湖区余杭塘 路866号 (72)发明人 王凤芹　汪以真　路则庆　程远之　 (74)专利代理 机构 杭州求是专利事务所有限公 司 33200 专利代理师 林松海 (51)Int.Cl. G01N 30/02(2006.01) G01N 30/06(2006.01) G01N 30/34(2006.01) G01N 30/72(2006.01) (54)发明名称 饲料中大观霉素的测定方法 (57)摘要 本发明公开了一种测定饲料中大观霉素的 方法。 试样中大观霉素用2%三氯乙酸水溶液 （含 0.4%乙二胺四乙酸二钠） 提取， 提取液经调节pH 值至4.7±0.2， 由混合型阳离子固相小柱净化， 采用HILIC色谱柱分离， 液相色谱质谱 ‑质谱联用 法测定， 基质匹配外标法定量。 结果表明： 本发明 建立的固相萃取 ‑超高效液相色谱 ‑串联质谱法 对饲料中大观霉素检出 限为1.0 mg/kg， 定量限 为2.0 mg/kg。 不同饲料基质中大观霉素浓度在 0.1~10.0μg/mL范围内线 性关系良好， 相关系数 （R2） 均大于0.99。 大观霉素的回收率为91.3%~ 104.2%， 相对标准偏差 （RSD） 为1.5%~9.4%。 本发 明建立的固相萃取 ‑超高效液相色谱 ‑串联质谱 法灵敏、 可靠， 可应用于饲料中大观霉素的准确 测定。 权利要求书1页 说明书10页 附图8页 CN 115452974 A 2022.12.09 CN 115452974 A 1.一种饲料中大观霉素的测定方法， 其特征是： 向待测饲料中加入质量分数为2%三氯 乙酸水溶液， 含0.4%乙二胺四乙酸二钠， 对大观霉素进行提取， 提取液经调节pH值至4.7 ± 0.2， 采用混合型阳离子MCX固相小柱净化， 采用HILIC色谱柱分离， 流动相A： 0.01  mol/L甲 酸铵水溶液和B： 0.01  mol/L甲酸铵乙腈 ‑水溶液， 梯度洗脱， 以电喷雾离子源正离子扫描 方 式， 在多反应监测模式下进行测定， 基质匹配外标法定量； 所述的流动相A为0.01  mol/L甲酸铵水溶液， 含0.4%甲酸， 称取0.63  g甲酸铵， 用100   mL水溶解， 再加入4  mL甲酸， 用水定容至1  000 mL， 混匀； 所述的流动相B 为0.01 mol/L甲酸铵乙腈 ‑水溶液， 含0.4%甲酸， 称取0.63  g甲酸铵， 用 100 mL水溶解， 再加入4  mL甲酸， 用乙腈定容至1  000 mL， 混匀。 2.根据权利要求1所述的方法， 其特 征是： 步骤如下： 称取待测饲料2.5  g， 置于50  mL塑料离心管中， 加入23  mL 2% TCA溶液， 再加入2  mL  5% EDTA‑2Na溶液， 常温水浴超声20  min， 于8 000 r/min离心5  min， 转移上清液至另一只 50 mL离心管中； 将沉淀重复提取一次并离心， 合并两次上清液， 混匀； 准确移取3  mL提取液 至10 mL塑料离心管中， 用10%氨水溶液准确调节pH至4.7 ±0.2后， 于8  000 r/min离心5   min， 制得样品备用液； 依次用3  mL甲醇和3  mL水活化MCX固相萃取小柱， 将样品备用液全部 上样， 分别用3  mL水和3 mL甲醇淋洗， 抽干； 用3  mL 10% 氨化甲醇溶液洗脱， 收集洗脱液， 于40℃氮气吹干， 准确加入3  mL样品溶解液， 其中流动相 A和B各50%， 复溶， 过0.22  μm有机 滤膜， 待UPLC‑MS/MS检测， 基质匹配外标法定量； 所述的2%三氯乙酸水 溶液为三氯乙酸2  mL， 加水稀释至10 0 mL； 所述的5%EDTA ‑2Na溶液为EDTA ‑2Na 5 g， 加水溶解并稀释至10 0 mL； 所述的10% 氨水溶液为氨水10  mL， 加水稀释至10 0 mL； 所述的10% 氨水甲醇溶 液为氨水10  mL， 加甲醇稀释至10 0 mL。 3.根据权利要求1所述的方法， 其特征是： 调节提取液pH至4.7 ±0.2， 步骤如 下： 准确移 取3 mL提取液至10 mL塑料离心管中， 用10% 氨水溶液准确调节pH 至4.7±0.2。 4.根据权利要求1所述的方法， 其特征是： 所述的基质匹配外标法定量， 步骤如下： 称取 各空白饲料样品8份， 每份2.5  g， 置于50  mL离心管中， 再向其中加入一系 列标准溶液， 静置 过夜。 5.按样品试验步骤进行提取、 调节pH值、 净化等处理， 形成理论添加浓度 为0、 0.1、 0.2、 0.5、 1.0、 2.0、 5.0和10.0  μg/mL的标准溶液， 上机测试， 以浓度为横坐标， 以定量离子的峰 面积为纵坐标， 绘制基质匹配标准工作曲线， 对样品中的大观霉素进行定量。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115452974 A 2饲料中大观霉素的测定方 法 技术领域 [0001]本发明涉及一种饲料中大观霉素的测定方法。 背景技术 [0002]大观霉素曾被广泛用于治疗家禽、 猪的细 菌和寄生虫感染， 或作为生长促进剂。 硫 酸大观霉素与盐酸林可霉素 的预混剂被用于预防猪赤痢、 沙门氏病菌、 大肠菌肠炎及支原 体肺炎。 考虑到饲用抗生素 的不合理及违法使用带来的抗生素在食物中残留、 细菌耐药性 以及环境污染等系列问题， 从源头掌握动物食品安全状况也越来越需要灵敏、 可靠的分析 方法作为饲料和食品检验的保障。 [0003]大观霉素 （化学结构见图1） ， 属于氨基糖苷类化合物， 结构上由氨基糖与氨基环醇 组成。 大观霉素具有热稳定性和非挥发性， 使用GC或GC ‑MS分析需要较长时间的衍生化反 应； 其结构上没有发色光团和荧光光团， 使用液相色谱分析通常需要柱前或柱后衍生， 然后 用紫外或荧光检测。 上述方法均会因衍生效率或衍生物的稳定性低而导致方法的精密度较 差。 脉冲安培计、 蒸发光散射和化学发光检测无需任何衍生， 可以直接检测氨基糖苷类化合 物， 但不能进行确证， 同时灵敏度也 不够。 [0004]液相色谱 ‑质谱联用 （LC ‑MS/MS） 因其高选择性和准确性在饲料质量控制中占有突 出地位， 然而氨基糖苷类化合物极性大 的特性又限制 了其在常规反相色谱 ‑质谱联用上 的 应用。 离子对液相色谱法采用添加离子对试剂的方法延长了极性目标物在反相色谱柱上的 保留， 但是离子对试剂的使用会严重抑制质谱仪的电喷雾离子化效果， 大幅度降低仪器灵 敏度。 作为离子对液相色谱法的替代， 亲水相互作用液相色谱法 （HILIC） 在分析过程中对极 性目标物具有较强的保留， 并且HILIC流动相中高比例的有机相在电喷雾电离 （ESI） 过程中 快速反应蒸发， 相对于离子对 液相色谱， HILIC与ESI联用可以获得更高的灵敏度。 已有文献 报道采用HILIC分离大观霉素等氨基糖苷类化合物  [STYPULKOWSKA  K， BLAZEWICZ  A，  BRUDZIKOWS KA A， et al. Development  of high performance  liquid chromatography   methods with charged aerosol detection  for the determination  of lincomycin，   spectinomycin  and its impurities  in pharmaceutical  products[J].  Journal of  Pharmaceutical  and Biomedical Analysis，  2015， 112:8‑14. ]。 [0005]来自样品中的基质效应往往限制了LC ‑MS/MS方法的重现性和准确 度。 在去除样品 基质的前处理方法中， 固相萃取 （SPE） 相 对于在流动相加入改进剂， 稀释， 稳定同位素标记 的内标物等方面普遍被认为更易于实现。 各种性能的离子型SPE小柱和亲水亲脂型 （HLB） SPE小柱常常用于去除样品中的基质。 氨基糖苷类化合物的净化涉及离子交换机制， 通常采 用阳离子交换小柱， 其填料的性质对加载的提取液pH值有较为严格的要求， 因此采用SP E小 柱净化提取液时， 往往需要调节上样溶液的pH值， 而使 得氨基糖苷类化合物在SP E小柱上得 以保留。 关于饲料中大观霉素的测定， 我国现行标准 《饲料中大观霉素的测定》 （农业部208 6 号公告‑7‑2014） 提供了两种分析方法： 高效液相色谱 ‑蒸发光散射检测法和液相色谱 ‑质谱 联用法。 其中， 高效液相色谱 ‑蒸发光散射检测法不能满足确证需要， 且只适用于配合饲料说　明　书 1/10 页 3 CN 115452974 A 3