(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210546042.X (22)申请日 2022.05.20 (71)申请人 肖尊平 地址 422300 湖南省邵阳市洞口县文昌街 道平渡村二组31号 (72)发明人 肖尊平　 (51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01) C12R 1/125(2006.01) (54)发明名称 一种可进行开放式液体培养发酵的枯草芽 孢杆菌培养方法 (57)摘要 本发明公开了一种可进行开放式液体培养 发酵的枯草芽孢杆菌培养方法， 包括以下步骤： 步骤a： 将酪蛋白胰酶消化物15g、 大豆粉木瓜蛋 白酶消化物5g、 氯化钠5g和琼脂15g， 加入水定容 至1000ml， 通过氢氧化钠溶液将PH值调节至7.3 ±0.2， 制成大豆酪蛋白琼脂培养基， 步骤b： 将大 豆酪蛋白琼脂培养基添加于锥形瓶中， 添加至盛 装不高于总容量20%的大豆酪蛋白琼脂培养基， 通过辐照杀菌40 ‑60min。 本发明根据菌株的特 性， 将枯草芽孢杆菌菌种与培养基成分混合制成 枯草芽孢杆菌菌粉， 然后将采用开放式液体培养 方法进行小规模枯草芽孢杆菌的发酵培养， 无需 灭菌、 接种和密闭培养条件， 不仅方便枯草芽孢 杆菌制剂用户的使用， 更能大幅降低单位活菌数 的生产成本 。 权利要求书2页 说明书6页 CN 114717163 A 2022.07.08 CN 114717163 A 1.一种可进行开放式液体培养发酵的枯草芽孢杆菌培养方法， 其特征在于： 包括以下 步骤： 步骤a： 将酪蛋白胰酶消化物 15g、 大豆粉木瓜蛋白酶消化物5g、 氯化钠5g和琼脂15g， 加 入水定容至1000ml， 通过氢氧化钠溶液将PH值调节至7.3 ±0.2， 制成大豆酪蛋白琼脂培养 基； 步骤b： 将大豆酪蛋白琼脂培养基添加于锥形瓶中， 添加至盛装不高于总容量20%的大 豆酪蛋白琼脂培养基， 通过辐 照杀菌40 ‑60min， 灭菌完毕后加入枯草芽孢杆菌菌种， 将 培养 基加热至 37℃后震荡摇匀培 养8‑12h， 制成发酵菌种； 步骤c： 将大豆酪蛋白琼脂培养基通过高温高压灭菌， 随后冷却至40℃以上， 将大豆酪 蛋白琼脂 培养基溶液装入培养皿中， 继续冷却至室温， 使大豆酪蛋白琼脂 培养基凝固； 步骤d： 将发酵菌种接种至培养基中， 按照8： 90的质量比混合， 发酵完成后制成枯草芽 孢杆菌制剂， 将枯草芽孢杆菌制剂和玉米淀粉进行混合， 并通过喷雾干燥的方式使其充分 干燥， 再将干燥后的枯 草芽孢杆菌 菌粉粉碎； 步骤e： 将枯草芽孢杆菌菌粉通过喷雾干燥的方式将其含水量控制在<8%， 制成的将枯 草芽孢杆菌 菌粉使用真空包 装机对枯 草芽孢杆菌 菌粉进行真空分装； 步骤f： 将无水葡萄糖3.5g、 蛋白胨0.8g、 酵母膏0.5g、 磷酸二氢钾0.35g和碳酸钙 0.25g， 加水至1000ml制成培养液， 随后通过120℃高温对培养液进行高温消毒， 消毒后的培 养液冷却至室温后， 进行真空封装； 步骤g： 将培养液与水比例为1： 0.7快速混合， 混合后加热至沸腾， 冷却后加入枯草芽孢 杆菌菌粉快速搅拌混合， 随后将温度控制在34 ±2℃， 培养16h即可得到枯草芽孢杆菌制剂。 2.根据权利要求1所述的一种可进行开放式液体培养发酵的枯草芽孢杆菌培养方法， 其特征在于： 所述步骤a通过培养基混合设备对培养基溶液进行搅拌混合， 混合时间为10 ‑ 20min， 混合完毕后将培 养基溶液排出至量 瓶中暂存。 3.根据权利要求1所述的一种可进行开放式液体培养发酵的枯草芽孢杆菌培养方法， 其特征在于： 所述步骤b通过紫外线杀菌器使用 254纳米波长的UV光对培养基进行辐照消 毒， 通过恒温摇床对培 养基进行恒温摇匀。 4.根据权利要求1所述的一种可进行开放式液体培养发酵的枯草芽孢杆菌培养方法， 其特征在于： 所述步骤c通过高压蒸汽灭菌器对培养基溶液进行高压消毒， 进行120℃和 30min的高温灭菌处理， 通过培养基保存箱对培养皿中的培养基进 行储存， 使其在无菌环 境 冷却至40℃以下产生凝固。 5.根据权利要求1所述的一种可进行开放式液体培养发酵的枯草芽孢杆菌培养方法， 其特征在于： 所述步骤 d通过恒温发酵箱使培养基中的菌种进行发酵， 发酵温度为37℃， 发 酵时间为24h， 枯草芽孢杆菌制剂和玉米淀粉的混合时间为40 ‑60min， 搅拌速度为190rpm， 通过粉碎搅拌机对快速粉碎， 将菌粉 粉碎为120目以上的粉状颗粒。 6.根据权利要求1所述的一种可进行开放式液体培养发酵的枯草芽孢杆菌培养方法， 其特征在于： 所述步骤e通过喷雾干燥机对枯草芽孢杆菌菌粉进行干燥处理， 干燥温度为 70‑80℃， 真空包 装机对枯 草芽孢杆菌 菌粉分装每 袋包装容量为1L。 7.根据权利要求1所述的一种可进行开放式液体培养发酵的枯草芽孢杆菌培养方法， 其特征在于： 所述步骤f通过高压蒸汽灭菌器对培养液进行高温消毒， 消毒时间为40 ‑权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114717163 A 260min， 消毒冷却后通过真空包 装机进行包 装。 8.根据权利要求1所述的一种可进行开放式液体培养发酵的枯草芽孢杆菌培养方法， 其特征在于： 所述步骤g通过搅拌装置对培养液与水进行混合， 混合时间为10 ‑15min， 培养 液与枯草芽孢杆菌 菌粉混合后通过持续加热， 使其保持在 恒定温度。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114717163 A 3