(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210559193.9 (22)申请日 2022.05.22 (83)生物保 藏信息 CCTCC NO:M2021383 2021.04.16 (71)申请人 郑州大学 地址 450001 河南省郑州市高新 技术开发 区科学大道100号 (72)发明人 许敬亮　赵安琪　李亚梅　吴利霞　 王勉　张晓琴　应汉杰　吕永坤　 阿拉牧　 (51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01) C12P 33/02(2006.01) C12R 1/32(2006.01) (54)发明名称 一种分枝杆菌固定化生产雄甾-1,4-二烯- 3,17-二酮 （AD D） 的方法 (57)摘要 本发明公开了一种分枝杆菌的固定化方法 及其应用， 属于工业生物技术领域。 以珍珠岩或 珍 珠 棉 作 为 固 定 化 载 体 ，将 分 枝 杆 菌 Mycobacterium  sp.CCTCCM  2021383活化后接入 固定化发酵培养基中培养， 使菌株在培养的过程 中自发地吸附于载体上， 所得固定化细胞用于将 植物甾醇转化为雄甾 ‑1,4‑二烯‑3,17‑二酮 (ADD)。 以珍珠岩和珍珠棉为载体制备得到的固 定化细胞稳定性较好， 可反复批次发酵20次以 上。 相比于无载体分枝杆菌直接发酵， 珍珠岩固 定化分枝杆菌细胞ADD产量提高60％。 此外， 通过 对固定化发酵培养基成分进行优化， ADD单批次 平均产量达 到4.03g/L。 权利要求书1页 说明书6页 附图5页 CN 114854636 A 2022.08.05 CN 114854636 A 1.一种分枝杆菌固定化 生产雄甾 ‑1,4‑二烯‑3,17‑二酮(ADD)的方法。 2.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述的分枝杆菌为Mycobacterium   sp.CCTCC M 2021383， 该菌已于2021年 4月23日保藏于中国典型培 养物保藏中心。 3.根据权利要求1所述的方法， 其特 征在于， 包括如下步骤： (1)菌种活化： 将 ‑80℃冻存保藏的分枝杆菌菌株接种到3mL  LB液体培养基中， 于30℃、 200rpm摇床中培 养48h进行活化。 (2)种子培养： 将分枝杆菌活化菌液接种于30mL种子培养基中， 于30℃、 200rpm摇床中 培养36h。 (3)细胞固定化： 将颗粒较均一的珍珠岩(直径约 5mm)及珍珠棉(直径约10mm)浸泡于去 离子水中， 再洗涤， 干燥， 即得珍珠岩和珍珠棉固定化载体。 将所述的珍珠岩或珍珠棉固定 化载体分别以80～420g/L、 5g/L的添加量置于固定化发酵培养基中， 于115℃灭菌20min。 灭 菌结束后， 将种子液按10％的接种量接种于30mL固定化发酵培养基中(含固定化载体)， 于 30℃、 200rpm摇床中培 养96h， 使菌体在培 养过程中自发地吸附于载体上。 (4)固定化细胞反复批次发酵： 上一批次发酵结束后， 倒掉发酵液， 回收固定化细胞， 经 过清洗后， 加入新鲜的固定化发酵培 养基进行 下一批次的反应。 4.根据权利要求3所述的方法， 其特 征在于， 所述种子 培养基成分为： 25g/L 果糖， 10g/L胰蛋白胨， 6g/L酵母 粉， 10g/L氯化钠。 所述固定化发酵培养基成分为： 25g/L果糖， 14.4g/L磷酸氢二铵， 9.6g/L黄豆饼粉， 10g/L氯化钠， 3g/L  K2HPO4， 0.2g/L MgSO4， 5×10‑4g/L MnCl2， 0～20g/L  HPD 826， 5～20g/L 植物甾醇， 0～40g/L羟丙基 ‑β‑环糊精(或0～15g/L硬脂酰乳酸钠)。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114854636 A 2一种分枝杆菌固定化生产雄甾 ‑1,4‑二烯‑3,17‑二酮(ADD)的 方法 技术领域 [0001]本发明属于工业生物技术领域， 具体涉及一种分枝杆菌固定化生产雄甾 ‑ 1,4‑二 烯‑3,17‑二酮(ADD)的方法。 背景技术 [0002]甾体激素类药物对人类身体机能起着重要的调节作用， 其广泛应用于治疗心血管 疾病、 类风湿性关节炎、 肿瘤、 哮喘、 人体器官移植排异、 内分泌失调和老年性疾病等， 已发 展成为仅次于抗生素的第二大医疗药物。 目前， 大约有300种甾体类药物获得批准， 年产量 超过100万吨。 在工业上， 甾体类药物的生产通常包括两个模块， 一是由具有甾烷母核结构 的天然物质为原料加工得到甾体药物中间体， 二是由甾体药物中间体加工制备各种甾体药 物。 因此甾体药物中间体的合成是甾体药物工业生产的重要环节， 对甾体药物制备 的工艺 和成本都有重要影响。 [0003]薯蓣皂苷元是加工甾体药物中间体 的传统原料， 然而， 由于生态环境的退化和 资 源的过度开采， 野生薯蓣皂苷元日益短缺。 因此， 有必 要寻找薯蓣皂苷元的替代品并完善相 关技术。 商用植物甾醇以其丰富的资源和 低廉的成本受到实验室研究人员和制药企业的广 泛关注。 原料市场上的商业植物甾醇通常是植物油精炼工业的副产品或废弃物， 主要由β ‑ 谷甾醇、 豆甾醇、 菜油甾醇和菜籽甾醇组成。 [0004]自然界中有多种微生物能够分解代谢植物甾醇或者胆固醇， 并将产生的能量用于 自身生长与繁殖。 放线菌属， 特别是分枝 杆菌属的微生物， 可以作为细胞工厂将植物甾醇中 的不同甾体 成分转化为甾体药物中间体， 避免了传统甾体化学工业中潜在的薯蓣皂苷元供 应不足的问题。 此外， 甾体药物中间体的生物合成也表现出了传统化学合成途径所没有的 优势： 反应条件温和、 产生的污染物较少、 工艺更加环保、 满足可持续性 发展的需求。 分枝杆 菌可转化植物甾醇生产多种甾体药物， 如可的松、 皮质酮、 孕酮、 雄酮等， 其中雄酮等性激素 前体如雄甾 ‑4‑烯‑3,17‑二酮(AD)与雄甾 ‑1,4‑二烯‑3,17‑二酮(ADD)的市场需求量较大， 可达到10亿美元。 [0005]细胞固定化技术具有操作简单、 可长期保持细胞活力、 重复性好、 稳定性好、 耐受 性高等优点， 在生物发酵领域具有广阔的应用前景。 与游离细胞发酵相比， 固定化细胞在复 杂的环境中表现出更强的生长和代谢能力， 它 可以提高产品发酵效率， 还能缓解因底物和 产物浓度高而对细胞 的抑制作用。 目前， 应用于分枝杆菌的固定化方法常用的有吸 附法和 包埋法。 冯丽桦等采用3％海藻酸钠包埋分枝杆菌细胞， 雄甾 ‑4‑烯‑3,17‑二酮(AD)得率明 显高于游离细胞发酵， 且发酵时长缩短了24h。 但是海藻酸钙凝胶小球机械性能较差， 在摇 瓶发酵过程中容易破碎， 并且以包埋法固定化细胞用于催化会使得传质阻力问题更为严 重。 吸附法固定化细胞成本低且操作简单， 且吸附固定化细胞可以不断更新， 死细胞会随着 培养基的流动而自动脱落， 附着空间被新生细胞替代， 从而保持较高的细胞 活性。 王艳婷 等 采用丝瓜络吸附法固定化分枝 杆菌细胞生产雄甾 ‑4‑ 烯‑3,17‑二酮(AD)， 可获得更好的生说　明　书 1/6 页 3 CN 114854636 A 3