(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210570363.3 (22)申请日 2022.05.24 (71)申请人 南京工业大 学 地址 211816 江苏省南京市浦口区浦珠南 路30号 (72)发明人 任路静　卢健尧　胡学超　张蓓　 胡鹏宸　郭迅　 (74)专利代理 机构 江苏致邦律师事务所 32 230 专利代理师 尹妍　徐蓓 (51)Int.Cl. C12N 13/00(2006.01) C12N 1/20(2006.01) C12N 1/38(2006.01) C12P 7/66(2006.01) C12R 1/07(2006.01) (54)发明名称 一种调控电子传递链提高维生素K2产量的 方法 (57)摘要 本发明公开了一种调控电子传递链提高维 生素K 2产量的 方法 ， 使 用纳豆芽孢杆菌 （Bacillus  natto） 作为维生素K2生产菌株， 对维 生素K2生产菌株进行电刺激， 对电刺激后的维生 素K2菌株进行种子培养和发酵培养； 发酵培养基 中添加烟酸、 β ‑烟酰胺单核苷酸、 色氨酸或外源 电子受体。 使用本发明的优化方法进行 维生素K2 生产， 甘油消耗降低了 75%， 维生素K2产量提高了 55%， 单位产量提高124%。 胞内NAD+、 NADH、 NADH/ NAD+水平较对照组分别提高了12%， 54%和38%， ATP浓度提高了73% 。 本发明通过简单的菌种刺激 和物质添加的策略实现了维生素K2产量的提升， 降低了发酵成本， 适 合工业化生产。 权利要求书1页 说明书5页 附图1页 CN 114854732 A 2022.08.05 CN 114854732 A 1.一种调控电子传递链提高维生素K2产量的方法， 其特征在于， 对维生素K2生产菌株 进行电刺激， 对电刺激后的维生素 K2菌株进行种子 培养和发酵培 养； 所述发酵培 养基添加烟酸、 β ‑烟酰胺单核苷酸、 色氨酸或外源电子受体中的一种； 所述维生素 K2生产菌株为纳豆 芽孢杆菌 （ Bacillus natto） 。 2.根据权利要求1所述的方法， 其特 征在于， 电刺激的电压为0.3V~0.5V， 优选 0.4V。 3.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 利用微生物电合成方法对维生素K2生产菌 株进行电刺激； 微生物电合成体系中， 电极为碳毡材料， 使用中性红溶液作为电子传递介 质。 4.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 发酵培养基中初始添加0.25 ‑2 g/L烟酸， 或2‑8 g/L β‑烟酰胺单核苷酸， 或2 ‑10 g/L 色氨酸。 5.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述外源电子受体为硫酸钠、 硝酸钠中的 一种或两种。 6.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述外源电子受体为1 ‑5 g/L硫酸钠或1 ‑5  g/L硝酸钠。 7.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述发酵培养基添加烟酸、 β ‑烟酰胺单核 苷酸、 色氨酸中的一种及外源电子受体； 所述烟酸、 β ‑烟酰胺单核苷酸、 色氨酸和外源电子受体分开添加， 即： 在发酵培养基 中初始添加烟酸、 β ‑烟酰胺单核苷酸、 色氨酸中的一种； 发酵培养 中期在 发酵培养基中添加外源电子受体； 或在发酵培养基中初始添加外源电子受体， 发酵培养中期在发酵培养基中添加烟酸、 β‑烟酰胺单核苷酸、 色氨酸中的一种。 8.根据权利要求7所述的方法， 其特征在于， 在发酵培养基中初始添加烟酸、 β ‑烟酰胺 单核苷酸、 色氨酸中的一种； 发酵培 养中期在发酵培 养基中添加外源电子受体。 9.根据权利 要求7或8所述的方法， 其特征在于， 所述发酵培养中期添加指发酵24h ‑48h 时添加。 10.根据权利要求9所述的方法， 其特征在于， 所述发酵培养中期添加指发酵24h时添 加。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114854732 A 2一种调控电子传递链提高维生素K2产量的方 法 技术领域 [0001]本发明属于生物技 术领域， 具体涉及一种生物法制备维生素 K2的发酵调控工艺。 背景技术 [0002]维生素K2是一类脂溶性维生素， 为甲萘 醌类系列化合物， 其结构由2 ‑甲基‑1， 4‑萘 醌母核和不同长度的异戊二烯侧链构成。 根据其分子结构上C ‑3位异戊二烯侧链数量的不 同可分为不同的异构体。 其中， 含有七个异戊二烯侧链的甲萘醌 ‑7 （MK‑7） 是维生素K2活力 最高的结构形式。 维生素K2具有预防和治疗骨质疏松症、 心血管疾病和动脉钙化等疾病的 作用。 由于微生物发酵生产的甲萘醌具有 更高的生物活性， 近年来受到研究者的广泛关注。 纳豆芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌的一个亚种， 是FDA认可的40种可食用益生菌 之一。 由于其生 长速度快， 甲萘醌含量高并已通过安全性认证， 被认为是工业化生产甲萘醌最有潜力的菌 株。 [0003]目前， 针对生物法制备维生素K2的技术主要集中在： （1） 通过对纳 豆芽孢杆菌进行 诱变育种提高其产能； （2） 营养和培养环境的优化； （3） 异源构建维生素K2的代谢途径， 促进 生产。 其中， 菌种诱变筛选的方法效果明显， 但是工作量大； 营养和环境优化的方法易于操 作但对产量提升效果有限； 利用基因工程法所生产的维生素K2 仍需要卫生部的相关批文才 能应用。 因此， 开发新型的发酵调控方法， 对于提升维生素 K2的产量具有重要的研究意 义。 发明内容 [0004]针对现有方法中， 发酵过程调控方法有限且效果不明显 的问题， 本发明提供了一 种基于电子传递链的发酵调控方法。 [0005]为实现上述 技术目的， 本发明采用如下技 术方案： 一种调控电子传递链提高维生素K2产量的方法， 对维生素K2生产菌株进行电刺 激， 对电刺激后的维生素 K2菌株进行种子 培养和发酵培 养； 所述发酵培 养基添加烟酸、 β ‑烟酰胺单核苷酸、 色氨酸或外源电子受体中的一种； 所述维生素 K2生产菌株为纳豆 芽孢杆菌 （ Bacillus natto） 。 [0006]作为一种优选的实施方式， 电刺激的电压为0.3V~0.5V， 优选 0.4V。 [0007]作为一种优选的实施方式， 利用微生物电合成方法对维生素K2生产菌株进行电刺 激； 优选的， 微 生物电合成体系中， 电极为 碳毡材料， 使用中性红作为电子传递介质。 [0008]作为一种优选的实施方式， 发酵培养基中初始添加0.25 ‑2 g/L烟酸， 或2 ‑8 g/L  β‑烟酰胺单核苷酸， 或2 ‑10 g/L 色氨酸。 [0009]作为一种优选的实施方式， 所述外源电子受体为硫酸钠、 硝酸钠中的一种或两种。 [0010]作为一种优选的实施方式， 所述外源电子受体为1 ‑5 g/L硫酸钠或1 ‑5 g/L硝酸 钠。 [0011]作为一种优选的实施方式， 所述发酵培养基添加烟酸、 β ‑烟酰胺单核苷酸、 色氨酸 中的一种及外源电子受体；说　明　书 1/5 页 3 CN 114854732 A 3