(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210724643.5 (22)申请日 2022.06.23 (71)申请人 南京中医药大学 地址 210023 江苏省南京市栖霞区仙林大 道138号 (72)发明人 王令充　谢佳雨　刘涛　虞晓弦　 嵇晶　程建明　狄留庆　 (74)专利代理 机构 南京经纬专利商标代理有限 公司 32200 专利代理师 陆志斌 (51)Int.Cl. C07K 14/435(2006.01) C07K 1/34(2006.01) C07K 1/14(2006.01) C07K 1/18(2006.01)C07K 1/22(2006.01) C07K 1/36(2006.01) A61K 38/17(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A61P 1/16(2006.01) (54)发明名称 一种具有抗肝癌和抑制肝纤维化功效的土 鳖虫蛋白提取物及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种具有抗肝癌和抑制肝纤 维化功效的土鳖虫蛋白提取物， 其制备方法为： 取干燥土 鳖虫打粉， 加入乙醇中， 回流提取， 合并 提取液， 减压浓缩， 离心， 收集上清液， 冷冻干燥， 得土鳖虫乙醇提取物EE粉末； 将土鳖虫乙醇提取 物EE粉末溶解于Tri s‑HCl缓冲液中， 将 硫酸铵添 加到溶液中至饱和状态， 搅拌， 静置， 离心， 收集 沉淀， 复溶后透析 以脱除盐分， 冷冻干燥可得土 鳖虫粗蛋白样品EEP。 本发明通过大量实验筛选， 对土鳖虫蛋白成分系统深入研究， 分离出了活性 蛋白部位EEPC及活性蛋白成分PC3 ‑III， 活性蛋 白部位EEPC及活性蛋白成分PC3 ‑III通过抑制肿 瘤细胞生长、 诱导肿瘤细胞凋亡、 抑制肿瘤细胞 迁移来共同发挥抗肝癌药效， 并且能通过抑制活 化的HSC细胞增殖来延缓肝纤维化的进程。 权利要求书2页 说明书8页 序列表1页 附图7页 CN 115109135 A 2022.09.27 CN 115109135 A 1.一种具有抗肝癌和抑制肝纤维化功效的土鳖虫蛋白提取物， 其特征在于， 它是通过 以下方法制备 得到的： (1)取干燥土鳖虫打粉， 加入乙醇中， 回流提取， 合并提取液， 减压浓缩， 离心， 收集上清 液， 冷冻干燥， 得土鳖 虫乙醇提取物E E粉末； (2)将步骤(1)制备得到的土鳖虫乙醇提取物EE粉末溶解于Tris ‑HCl缓冲液中， 将硫酸 铵添加到溶液中至饱和 状态， 搅拌， 再静置， 离心， 收集沉淀， 复溶后透析以脱除盐分， 冷冻 干燥可得土鳖虫粗蛋白样品E EP。 2.根据权利要求1所述的一种具有抗肝癌和抑制肝纤维化功效的土鳖虫蛋白提取物， 其特征在于， 它是通过以下 方法制备 得到的： (1)取干燥土鳖虫打粉， 加入5～20倍体积量的20～30％乙醇， 60 ‑75℃条件回流提取1 ～3次， 每次1～2h， 合并提取液， 减压浓缩， 离心， 收集上清液， 冷冻干燥可得土鳖虫乙醇提 取物EE粉末； (2)将步骤(1)制备得到的土鳖虫 乙醇提取物EE粉末溶解于30mM  Tris‑HCl缓冲液中， 将硫酸铵 添加到溶液中至饱和状态， 搅拌， 再静置， 离心， 收集沉淀复溶后透析36h以脱除盐 分， 冷冻干燥可 得土鳖虫粗蛋白样品E EP。 3.一种具有抗肝癌和抑制肝纤维化功效的土鳖虫蛋白提取物， 其特征在于， 它是通过 以下方法制备 得到的： (1)取干燥土鳖虫打粉， 加入乙醇中， 回流提取， 合并提取液， 减压浓缩， 离心， 收集上清 液， 冷冻干燥， 可 得土鳖虫乙醇提取物E E粉末； (2)将步骤(1)制备得到的土鳖虫乙醇提取物EE粉末溶解于Tris ‑HCl缓冲液中， 将硫酸 铵添加到溶液中至饱和 状态， 搅拌， 再静置， 离心， 收集沉淀， 复溶后透析以脱除盐分， 冷冻 干燥可得土鳖虫粗蛋白样品E EP； (3)将粗蛋白土鳖虫粗蛋白样品EEP复溶在Tris ‑HCl缓冲液中， 并先后使用截留分子量 为10kDa与3kD的超滤离心管连续2次的离心， 按照分子量将EEP溶液分为3个蛋白部位截留 液， 收集并冷冻干燥， 命名为分子量＜3k的EEPA、 分子量3～10k的EEPB及分子量＞10k的 EEPC。 4.根据权利要求3所述的一种具有抗肝癌和抑制肝纤维化功效的土鳖虫蛋白提取物， 其特征在于， 它是通过以下 方法制备 得到的： (1)取干燥土鳖虫打粉， 加入5～20倍体积量的20～30％乙醇， 60 ‑75℃条件回流提取1 ～3次， 每次1～2h， 弃去残渣， 合并提取液， 减压浓缩， 离心， 收集上清液， 冷冻干燥可得土鳖 虫乙醇提取物E E粉末， 使用前避光存 储于‑20℃条件； (2)将步骤(1)制备得到的土鳖虫 乙醇提取物EE粉末溶解于30mM  Tris‑HCl缓冲液中， 将硫酸铵 添加到溶液中至饱和状态， 搅拌， 再静置， 离心， 收集沉淀复溶后透析36h以脱除盐 分， 冷冻干燥可 得土鳖虫粗蛋白样品E EP； (3)将土鳖虫粗蛋白样品EEP粉末复溶在30mM  Tris‑HCl缓冲液中， 并先后使用截留分 子量为10kDa与3kD的超滤离心管连续2次的离心分离， 按照分子量将EEP溶液分为3个蛋白 部位截留液， 收集并冷冻干燥， 命名为分子量＜3k的EEPA、 分子量3～10k的EEPB及分子量＞ 10k的EEPC。 5.一种具有抗肝癌和抑制肝纤维化功效的土鳖虫蛋白提取物， 其特征在于， 它是通过权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115109135 A 2以下方法制备 得到的： (1)取干燥土鳖虫打粉， 加入5～20倍体积量的20～30％乙醇， 60 ‑75℃条件回流提取1 ～3次， 每次1～2h， 弃去残渣， 合并提取液， 减压浓缩， 离心， 收集上清液， 冷冻干燥可得土鳖 虫乙醇提取物E E粉末， 使用前避光存 储于‑20℃条件； (2)将步骤(1)制备得到的土鳖虫 乙醇提取物EE粉末溶解于30mM  Tris‑HCl缓冲液中， 将硫酸铵 添加到溶液中至饱和状态， 搅拌， 再静置， 离心， 收集沉淀复溶后透析36h以脱除盐 分， 冷冻干燥可 得土鳖虫粗蛋白样品E EP； (3)将土鳖虫粗蛋白样品EEP粉末复溶在30mM  Tris‑HCl缓冲液中， 并先后使用截留分 子量为10kDa与3kD的超滤离心管连续2次的离心分离， 按照分子量将EEP溶液分为3个蛋白 部位截留液， 收集并冷冻干燥， 命名为分子量＜3k的EEPA、 分子量3～10k的EEPB及分子量＞ 10k的EEPC； (4)将步骤(3)中分子量＞10k的EEPC溶解在pH  8.0的30Mm  Tris‑HCl缓冲液中， 上 DEAE‑52Cellulos阴离子柱层析， 用浓度为0～1.0M的NaCl进行梯度洗脱， 流速1ml/min， 280nm检测洗脱液馏分吸光度值， 绘制EEPC的DEAE洗脱图谱， 收集EEPC在DEAE柱层析上分离 的主要馏分PC3； 将馏分PC3进样Sephadex  G‑100层析柱上进一步纯化， 洗脱溶液为pH  8.0 的30Mm Tris‑HCl缓冲液， 流速0.75ml/min， 280nm检测洗脱液馏分吸光度值， 绘制EEPC的主 要馏分PC 3的Sephadex  G‑100洗脱图谱， 收集主 要产物PC 3‑III。 6.一种具有抗肝癌和抑制肝纤维化功效的土鳖虫蛋白， 其特征在于， 其包含氨基酸序 列QYSINFISARCNGD SCVCTFR。 7.权利要求1～5任一项所述的土鳖虫蛋白提取物在制备抗肝癌和抑制肝纤维化药物 或保健品中的应用。 8.权利要求6所述的土鳖虫蛋白在制备抗肝癌和抑制肝纤维化药物或保健品中的应 用。 9.根据权利要求7或8的应用， 将土鳖虫蛋白提取物或土鳖虫蛋白和药学上可接受 的载 体制成片 剂、 胶囊剂、 颗粒剂、 丸剂 剂型的药物。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115109135 A 3