(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210740612.9 (22)申请日 2022.06.27 (71)申请人 上海交通大 学 地址 200240 上海市闵行区东川路80 0号 (72)发明人 崔大祥　刘彬　 (74)专利代理 机构 上海科盛知识产权代理有限 公司 312 25 专利代理师 王颖 (51)Int.Cl. C12N 5/078(2010.01) C12N 5/02(2006.01) C12N 5/0783(2010.01) C12N 5/10(2006.01) C12N 15/115(2010.01) A61K 35/17(2015.01)A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 一种自然 杀伤细胞来源外泌体的提取、 修饰 方法及其应用 (57)摘要 本发明涉及一种自然杀伤细胞来源外泌体 的提取、 修饰方法及其应用， 用含有自体血浆和 IL‑2的MedGroTM免疫细胞培养基重悬PBMC， 调整 细胞密度为1 ‑2×106mL‑1， 并加入相同数量的滋 养层细胞， 于CO2湿润培养箱中进行NK细胞的诱 导培养， 从培养后的上清液中提取外泌体。 使用 靶向CXCR4的RNA 配体/吲哚菁绿对提取的NK外泌 体进行工程化修饰。 与现有技术相比， 本发明克 服了现有细胞来源外泌体制备技术存在的纯度 低， 产量低等不足， 所提取的外泌体经工程化修 饰后， 解决了当前细胞来源外泌体靶向效率低、 治疗效果差等问题。 权利要求书1页 说明书4页 附图3页 CN 115197908 A 2022.10.18 CN 115197908 A 1.一种自然杀伤细胞来源外泌体的提取方法， 其特征在于， 用含有自体血浆和IL ‑2的 MedGroTM免疫细胞培养基重悬PBMC， 调整细 胞密度为1‑2×106mL‑1， 并加入相同数量的滋养 层细胞， 于CO2湿润培养箱中进行NK细胞的诱 导培养， 从培养后的上清液中提取外泌体。 2.根据权利要求1所述的自然杀伤细胞来源外泌体的提取方法， 其特征在于， 所述的提 取外泌体的过程包括： 收集培养后的上清液， 去除细胞沉淀后离心， 留取上清液， 弃沉淀； 继 续用超滤管离心， 去除小分子杂质的同时浓缩细胞上清液； 将浓缩细胞上清液离心， 弃上清 液， 留住沉淀， 用磷酸盐缓冲液重悬后透析即可 得到所述的外泌体。 3.根据权利要求2所述的自然杀伤细胞来源外泌体的提取方法， 其特征在于， 收集培养 后的上清液， 去除细胞沉淀后在4℃条件 下以9000 ‑12000rpm的转速离心15 ‑100min， 留取上 清液， 弃沉淀； 继续用100kDa ‑150kDa超滤管以3000 ‑4000rpm的速度离心 5‑30min， 去除小分 子杂质的同时浓缩细胞上清液； 将浓缩细胞上清液在4℃条件下以8000g ‑100,000g的转速 离心60‑90min， 离心结束后， 弃 上清液， 留住沉淀 。 4.根据权利要求2所述的自然杀伤细胞来源外泌体的提取方法， 其特征在于， 用磷酸盐 缓冲液重悬沉淀后转移至 透析袋中， 透析6 ‑8h， 得到所述的外泌体。 5.根据权利要求1所述的自然杀伤细胞来源外泌体的提取方法， 其特征在于， 所述的NK 细胞经过12天连续培 养后， 从培 养后的上清液中提取外泌体。 6.根据权利要求1所述的自然杀伤细胞来源外泌体的提取方法， 其特征在于， 在第0天， 通过密度梯度离心获得2 ‑3×107个PBMC， 用含有5％自体血浆和400U  mL‑1的IL‑2的MedGroTM 免疫细胞培 养基重悬PBM C。 7.根据权利要求1所述的自然杀伤细胞来源外泌体的提取方法， 其特征在于， 加入相同 数量的滋养层细胞后， 将细胞培养瓶放置于CO2湿润培养箱中进行NK细胞的诱导培养， 滋养 层细胞分泌活化NK细胞所必须的IL ‑21和4‑1BB因子， 每隔1天， 添加一定体积的新鲜完全培 养基以确保细胞密度在1 ‑2×106mL‑1之间， 在第7天， 再次加入相同数量的滋养层细胞以进 行第二轮的NK细胞活化； 所述的完全培 养基含自体血浆和I L‑2。 8.一种自然杀伤细 胞来源外泌体的修饰方法， 其特征在于， 基于靶向CXCR4的RNA配体， 对采用如权利要求1～7任一项所述的提取 方法得到的外泌体进行工程 化修饰。 9.根据权利要求8所述的自然杀伤细胞来源外泌体的修饰方法， 其特征在于， 基于靶向 CXCR4的RNA配体， 将传统pRNA ‑3WJ结构扩展为箭头形结构， 一侧为CXCR4  aptamer， 另一侧 为吲哚菁 绿ICG与胆固醇， 得到RNA配体结构， 使用该RNA配体结构对提取的外泌体进 行工程 化修饰。 10.一种采用如权利要求8所述的修饰方法得到的外泌体的应用， 其特征在于， 将所述 的外泌体用于制备癌症的治疗药物。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115197908 A 2一种自然杀伤细胞来源外泌体的提取、 修饰方 法及其应用 技术领域 [0001]本发明涉及生物技术领域， 具体涉及一种自然杀伤细胞来源外泌体的提取、 修饰 方法及其应用。 背景技术 [0002]外泌体(exosome)是由很多类型细胞分泌的30 ‑150nm的“杯托状”磷脂双分子层囊 泡， 密度为1.13 ‑1.19g/mL， 携带多种蛋白质、 脂质和核酸， 功能复杂， 参与免疫调节、 调控细 胞外基质重构、 激活细胞的信号 通路等。 [0003]在癌症研究中， 以前的研究多数是探索癌细胞释放的外泌体， 但很少了解免疫细 胞释放的外泌体的功能。 自然 杀伤(NK)细胞对转移 性及血液恶性肿瘤具有天然 快速免疫作 用， NK细胞的抗肿瘤特性已经在临床实验阶段。 然而活细胞治疗会带来固有的风险： 如微血 管阻塞导致肺栓塞和死亡、 移 植细胞转化为不良的细胞类型或癌症、 免疫排斥反应、 心 律失 常、 骨化和/或钙化等。 用exosome替换细胞治疗可以避免这些问题， 例如由于exosome的小 尺寸可以避免血管闭塞和不良细胞类型的产生， 目前有研究表明NK细胞外泌体对肿瘤细胞 具有细胞毒性， 但是对正常细胞 无影响， 值得进一 步研究将其发展为癌症的治疗手段。 [0004]若要将NK细胞外泌体开发应用， NK细胞外泌体的高纯度大规模生产是不可回避的 一环。 虽然目前有报道大规模NK细胞外泌体的提纯方法(如： Jong  A Y,et al.[J].Journal   of Extracellular Vesicles,2 017,6(1):1294368)。 目前NK细胞外泌体的纯度、 产量、 治疗 效果等问题并没有得到很好的解决， 缺少一种能提取高纯度NK细胞外泌体并提高其靶向能 力与治疗能力的稳定方法。 发明内容 [0005]本发明的目的是提供一种自然杀伤细胞来源外泌体的提取、 修饰方法及其应用。 [0006]本发明的目的可以通过以下技术方案来实现： 一种自然杀伤细胞来源外泌体的提 取方法， 用含有自体血浆和IL ‑2的MedGroTM免疫细胞培养基重悬PBMC， 调整细胞密度 为1‑2 ×106mL‑1， 并加入相同数量的滋养层细胞， 于CO2湿润培养箱中进行NK细胞 的诱导培养， 从 培养后的上清液中提取外泌体。 [0007]优选地， 所述的提取外泌体的过程包括： 收集培养后的上清液， 去除细胞沉淀后离 心， 留取上清液， 弃沉淀； 继续用超 滤管离心， 去除小分子杂质的同时浓缩细胞上清液； 将浓 缩上清液离心， 弃 上清液， 留住沉淀， 用磷酸盐缓冲液重悬后透析即可 得到所述的外泌体。 [0008]进一步优选地， 收集培养后的上清液， 去除细胞沉淀后在4℃条件下以9000 ‑ 12000rpm的转速离心15 ‑100min， 留取上清液， 弃沉淀； 继续用100kDa ‑150kDa超滤管以 3000‑4000rpm的速度离心5 ‑30min， 去除小分子杂质的同时浓缩细胞上清液， 减少接下来的 超速离心的工作量及成本； 将浓缩上清液在4℃条件下以8000g ‑100,000g的转速离心60 ‑ 90min， 离心结束后， 弃 上清液， 留住沉淀 。 [0009]更进一步优选地， 去除细胞沉淀后在4℃条件下以10000 ‑12000rpm的转速离心说　明　书 1/4 页 3 CN 115197908 A 3