(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210753262.X (22)申请日 2022.06.28 (71)申请人 福建医科 大学孟超肝胆医院 （福州 市传染病医院） 地址 350002 福建省福州市西洪路312号 (72)发明人 吴名　刘小龙　曾永毅　丁磊　 (74)专利代理 机构 深圳峰诚志合知识产权代理 有限公司 4 4525 专利代理师 张腾 (51)Int.Cl. A61K 9/51(2006.01) A61K 31/713(2006.01) A61K 47/46(2006.01) A61K 47/24(2006.01) A61P 35/00(2006.01)C12N 15/867(2006.01) C12N 5/10(2006.01) C12N 15/12(2006.01) (54)发明名称 一种基因工程化细胞膜涂层脂质体纳米囊 泡及其制备与应用 (57)摘要 本发明提供一种基因工程化细胞膜涂层的 脂质体纳米囊 泡Adar1‑LNPs@mPD1及制备方法和 应用。 纳米囊泡的外层是PD1生物细胞膜构成， Adar1‑siRNA(siAdar1)负载到其脂质体的内核 中。 基因工程化细胞膜表面表达的PD1可与癌细 胞上的PD ‑L1蛋白结合， 阻断相关免疫抑制通路； 脂质体(LNP)纳米颗 粒具有高的核 酸负载效率及 良好的生物相容性； siAdar1可以有效地沉默 ADAR1的表达以诱导肿瘤炎症， 使肿瘤对干扰素 更加敏感。 通过上述功能的有机整合， Adar1 ‑ LNPs@mPD1可激活系统的抗肿瘤免疫， 实现显著 的肿瘤生长消退、 远端肿瘤预防和有效抑制肺转 移。 权利要求书1页 说明书7页 序列表3页 附图2页 CN 115120572 A 2022.09.30 CN 115120572 A 1.一种基因工程化细 胞膜涂层脂质体纳米囊泡Adar 1‑LNPs@mPD1， 其特征在于， 由生物 细胞膜和脂质混合物构成， 粒径50～200nm， 所述生物细胞膜表面转配有程序性死亡受体1 (PD1)， 脂质混合物内部负载A dar1‑siRNA(siA dar1)， Adar1 ‑siRNA为两条反向互补的DNA 链， 包括如SEQ  ID No.4所示的正 义链和如SEQ  ID No.5所示的反义链。 2.如权利要求1所述的基因工程化细胞膜涂层脂质体纳米囊泡， 其特征在于， 所述的生 物细胞膜来源于基因工程 化CHO细胞株。 3.如权利要求1所述的基因工程化细胞膜涂层脂质体纳米囊泡， 其特征在于， 所述的脂 质混合物由以下质量比1～10： 0.5～3： 1～5： 0.1～2： 0.1～2的物质： DOTAP、 DPPC、 CHO ‑HP、 DSPE‑mPEG2000、 siAdar1组成。 4.如权利要求1所述的基因工程化细胞膜涂层脂质体纳米囊泡， 其特征在于， 所述的细 胞膜的总蛋白与脂质混合物的质量比为0.2 ～2： 0.4～4。 5.如权利要求1～4任一项所述的基因工程化细胞膜涂层脂质体纳米囊泡的制备方法， 其特征在于， 由如下 方法构建获得： 步骤1.将如SEQ  ID No.2所示的编码PD1蛋白的基因序列插入到pCDH ‑CMV‑Puro空载质 粒中， 获得重组质粒； 步骤2.使用CHO细胞对重组质粒进行慢病毒包装， 浓缩病毒液感染CHO细胞， 并加入 polybrene增强感染效率， 用抗性药物Puro进行细胞筛选， 获得稳转细胞株； 将成功构建的 稳转细胞株进行扩大培养， 收集细胞， 用细胞膜和细胞蛋白抽提试剂盒提取PD1细胞膜， 使 用蛋白质定量BCA法进行总蛋白定量； 步骤3.将DOTAP、 DPPC、 CHO ‑HP和DSPE ‑mPEG2000脂质混合物溶解在乙醇中， 将所述 Adar1‑siRNA溶解在10～50mM柠檬酸缓冲 液中， 脂质混合物与Adar1 ‑siRNA以体积比1:2混 合， 冰浴超声1～10分钟后通过超滤并洗涤获得Adar1 ‑LNPs； 步骤4.PD1细胞膜通过超声使其充分破碎， 将质量浓度为0.2～2： 0.4～4的Adar1 ‑LNPs 与PD1细胞膜以体积比1:1冰浴超声1～10 分钟， 最后,收集产 物通过超滤并洗涤获得纳米囊 泡Adar1‑LNPs@mPD1。 6.权利要求1～4任一项所述的基因工程化细胞膜纳米囊泡在制备肿瘤免疫治疗药物 中的应用。 7.权利要求1～4任一项所述的基因工程化细胞膜纳米囊泡在制备肿瘤免疫检查点抑 制剂中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115120572 A 2一种基因工 程化细胞膜涂层脂质体纳米囊泡及其制备与应用 技术领域 [0001]本发明涉及 一种基因工程化细胞膜涂层脂质体纳 米囊泡及其制备方法， 以及 其在 制备肿瘤免疫 治疗药物中的应用。 背景技术 [0002]近年来备受关注的免疫疗法是利用免疫系统特征进行癌症治疗。 免疫疗法被视为 生物疗法的一种， 它是基于患者免疫系统对癌症的敏感性， 增加选择性并减少副作用， 其功 效已通过临床研究以及体外和体内研究得到证实。 癌症免疫疗法因临床试验中的成功被 《科学》 杂志评选为 “2013年度十大科学突破之一 ”。 目前， 有许多免疫治疗药物被美国食品 和药物管理局(FDA)批准用于癌症治疗： 用于肾癌细胞治疗的重组人IL ‑2； 首个针对B细胞 恶性肿瘤的单克隆抗体； 首个用于前列腺癌治疗的基于DC的癌症疫苗； 嵌合抗原受体(CAR) 工程细胞治疗B细胞淋巴瘤； 黑色素瘤的程序性死亡配体 ‑1(PD‑L1)免疫检查点阻断剂等。 程序性死亡蛋白1(PD1)是T细胞表面常见的免疫抑制成员， 在下调免疫系统和提高自身耐 受性方面发挥着重要作用。 其配体PD ‑L1在恶性肿瘤细胞表面过表达， 与PD1结合， 抑制PD1 阳性细胞增殖， 参与肿瘤免疫 逃逸导致治疗失败。 基于PD1/PD ‑L1通路在肿瘤免疫治疗中具 有重要价值， 近年来已成为重要的免疫检查点。 因此， 了解PD1/PD ‑L1的作用机制对于联合 免疫治疗以及改善患者预后具有重要意义。 PD1/PD ‑L1抑制剂已在许多类型肿 瘤中显示出 临床疗效， 例如， 用特异性抗体阻断PD1或PD ‑L1可增强T细胞反应并介导抗肿 瘤活性。 尽管 免疫检查点阻断疗法在临床上取得了巨大成功， 但免疫疗法的响应率仍然很低。 研究表明， 只有10‑30％的患者在接受PD1/PD ‑L1抑制剂后可以产生长期和持续的疗效。 大多数患者对 治疗没有明显 反应或保持对治疗的抵抗力， 其根源在于患者对靶向抑制剂不敏感。 PD1/PD ‑ L1抗体耐药的发展涉及许多肿 瘤相关过程， 包括PD ‑L1表达、 肿 瘤新抗原表达和传递、 相关 细胞信号通路、 肿瘤微环 境和表观遗传修饰。 肿瘤抗原的缺乏， 导T细胞无法识别PD1/PD ‑L1 抗体， 导致耐药。 此外， 处理和传递抗原的分子， 例如MHC  I类分子和β 2微球蛋白， 在其遗传 密码发生改变时也会导致对免疫检查点抑制剂(ICIs)的耐药性。 异常的细胞信号传导也是 导致免疫治疗耐药的一个因素， 如PI3K/Akt通路、 Wnt/β ‑连锁蛋白通路、 JAK/STAT/IFN ‑γ 通路和丝裂原活化蛋白激酶通路。 因此， 需要探索克服肿瘤 对免疫检查点阻断(ICB)耐药的 替代方法。 最近， 研究人员发现RNA编辑 酶ADAR1可以调节染色体末端基因组的稳定性， 这是 癌细胞生长所必需的。 众所周知， 原癌基因ADAR1在乳腺癌、 肝癌、 肺癌等肿 瘤中过表达， 促 进肿瘤的进展。 此外， Ishizuka等人发现， 肿瘤细胞中ADAR1活性的丧失使肿瘤对干扰素更 加敏感， 并增强肿 瘤炎症反应。 因此， 根据相关研 究表明， 设计ADAR1靶点是改善ICB治疗的 新策略。 发明内容 [0003]本发明目的是提供一种递送核酸的脂质体纳 米囊泡， 特异性沉默基因和蛋白的表 达， 使肿瘤微环境发生炎症反应并对干扰素更加敏感， 同时阻断PD1/PD ‑L1抑制轴， 实现增说　明　书 1/7 页 3 CN 115120572 A 3