(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210751176.5 (22)申请日 2022.06.28 (71)申请人 中国科学院海洋研究所 地址 266071 山东省青岛市 市南区南海路7 号 (72)发明人 吴宁　万家齐　邓真真　张全斌　 (74)专利代理 机构 沈阳科苑专利商标代理有限 公司 210 02 专利代理师 马驰 (51)Int.Cl. A61K 47/55(2017.01) A61K 41/00(2020.01) A61K 9/14(2006.01) A61K 31/513(2006.01) A61K 31/713(2006.01)A61K 31/715(2006.01) A61K 47/36(2006.01) A61K 47/02(2006.01) A61K 47/34(2017.01) A61P 35/00(2006.01) B82Y 5/00(2011.01) B82Y 30/00(2011.01) B82Y 40/00(2011.01) (54)发明名称 一种多功能基因载体及其在递送miRNA中的 应用 (57)摘要 一种多功能基因载体及其在递送miRNA中的 应用。 本发明属于生物医药技术领域， 具体涉及 一种以岩藻多糖包覆的聚乙烯亚胺(PEI)修饰的 磁性纳米颗 粒多功能基因载体及在递送miRNA中 的应用。 该纳米颗粒内核为聚乙烯亚胺(PEI)修 饰的Fe3O4纳米颗粒， 表面通过静电吸附包覆岩 藻多糖， 并且 该纳米颗粒能进一步通过自组装结 合miRNA， 用于miRNA的靶向递送 。 其中， 岩藻多糖 和miRNA层层自组装至PEI修饰的磁性Fe3O4内 核， 制备方法简单， 条件温和， 易于操作和重复。 并且， 本发 明的岩藻糖复合纳米载体可以借助载 体中的磁性纳米内核实现 组织靶向递送， 从而实 现肿瘤的系统化靶向治疗。 该纳米颗粒具有无免 疫原性、 高靶向性等特征， 在基于miRNA的功能研 究、 疾病的治疗及临床应用中有很好的应用前 景。 权利要求书1页 说明书6页 附图4页 CN 115120736 A 2022.09.30 CN 115120736 A 1.一种多功能基因载体， 其特征在于： 由包覆岩藻多糖的聚乙烯亚胺修饰的磁性四氧 化三铁纳米颗粒组成。 2.根据权利要求1所述的一种 多功能基因载体， 其特征在于： 所述磁性 四氧化三铁纳米 颗粒的平均粒径为5 0‑150nm。 3.一种权利要求1所述的多功能基因载体的制备方法， 所述磁性纳米颗粒的制备方法 为: (1)纳米磁核的制备 将10～15mmol无水 氯化铁， 优选为15mmol， 3～5mmol氢氧化钠， 优选为5mmol， 45～55mL 乙二醇， 优选为50mL和3.6mL无菌水混合均匀后转移到三口瓶中， 加热至沸腾， 随后 保持沸 腾回流8h～12h， 停止反应， 冷却至室温， 经磁性分离、 洗涤得到F e3O4纳米颗粒， 备用； (2)三聚磷酸钠的交联和聚乙烯亚胺(PEI)修饰 将步骤(1)得到的Fe3O4纳米颗粒分散于50mL超纯水中， 加入 三聚磷酸钠， Fe3O4纳米颗粒 与三聚磷酸钠的质量比为1： 1至1： 1.5， 优选为1： 1.2， 混合均匀， 室温反应30～50min， 得到 四氧化三铁磷酸盐纳米颗粒； 将上述反应后的四氧化三铁磷酸盐纳米颗粒磁性分离后重新 分散于超纯水中； 将得到的溶液缓慢加入50 ‑80mL浓度为80～100mg/L聚乙烯亚胺(PEI)水 溶液中， 室温搅拌20～30min使混合均匀， 经磁性分离， 重悬至100 ‑120mL无菌超纯水中得到 聚乙烯亚胺(PEI)包覆磁性氧化铁纳米颗粒的溶 液； (3)岩藻多糖的自组装 将步骤(2)得到的纳米颗粒溶液与岩藻多糖溶液室温下混合吸附30～40min， 7000～ 8000rpm离心10～20min， 弃掉上清， 加入无菌超纯水水重悬， 制得结合岩藻多糖的磁性纳米 颗粒(Fuc ‑NPs)。 4.根据权利要求3所述的制备方法， 其特征在于： 所述岩藻多糖的分子量范围为5kDa～ 130kDa， 优选为80～13 0kDa。 5.根据权利要求3所述的制备方法， 其特征在于： 其特征在于： 纳米颗粒溶液与岩藻多 糖的质量比为3： 1～1： 1， 其中最优为2： 1。 6.一种权利要求1所述的多功能基因载体在递送具有抗肿瘤活性的miRNA中的用途。 7.根据权利要求6所述的多功能基因载体在递送具有抗肿瘤活性的miRNA中的用途， 其 特征在于： miRNA与磁性纳米颗粒的结合方法为： 结合岩藻多糖的磁性纳米颗粒(Fuc ‑NPs)溶液与无菌水溶解的miRNA(20 μM)混合， 两者 在室温吸附30～40min， 使miRNA组装至磁核， 离心7000～8000rpm， 10～2 0min， 弃上清， 用无 菌水重悬， 制得负载miRNA磁性纳米颗粒(Fuc ‑miRNA NPs)。 8.根据权利要7所述的多功能基因载体在递送具有抗肿瘤活性的miRNA中的用途， 其特 征在于： 其中， Fuc ‑NPs溶液与miRNA的体积比为20： 1～10： 3， 其中最优为10： 1。 9.权利要求1 ‑6任一项所述的多功能基因载体负载有抗肿瘤活性的miRNA分子得到的 复合物。 10.权利要求8所述的复合物在制备 预防或抗肿瘤疾病的药物或制剂中的用途。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115120736 A 2一种多功能基因载体及其在递 送miRNA中的应用 技术领域 [0001]本发明属于生物医药技术领域， 具体涉及多功能基因载体的制备及在递送miRNA 中的应用。 背景技术 [0002]区别于传统的化疗药物和生物药物(抗体和细胞药物)， 核酸药物(例如siRNA和 miRNA)能够以化学药物或抗体药物无法靶向的分子作为作用靶点， 有望对传统药物疗效不 佳的疾病产生突破性的进展， 特别是难以治疗的遗传 疾病、 癌症等。 但是核酸类药物的输送 面临着很大的问题。 核酸药物进入细胞面临两大挑战， 一个是RNA 暴露在血液中容易被血浆 和组织中的RNase降解， 而且会引发不必要的免疫反应； 另一个是带负电的RNA难以跨膜进 入胞内， 所以需要一个递送系统将它们传送到细胞中行使功能。 递送平台的开发是整个核 酸疗法产业链条的重点， 也是核酸疗法获得成功的必要条件。 [0003]随着纳米科技的发展， 纳米材料成为递送miRNA的新选择。 例如Hosseinpour等将 miRNA‑26a‑5p封装在介孔二氧化硅纳米粒(MSN ‑CC‑PEI)中， 并将其包裹在聚乙烯亚胺 (MSN‑CC‑PEI)上， 作为向大鼠骨髓间充质细胞促进其成骨分化的系统， 该递送体系在体内 表现出稳定性和高效性。 [0004]岩藻多糖是一种海洋来源的硫酸多糖， 已经被纳入纳米医学应用领域中。 岩藻多 糖可用于纳米递药体系， 不仅可以稳定纳米载体， 还可增加增强化疗 药物的抗癌活性。 公布 号CN 108451931  A的专利公布了一种由聚丙烯胺盐酸盐和岩藻聚糖通过聚电解质复合法 制成的纳米颗粒， 可以增加 化疗药物甲氨蝶呤的抗癌活性。 我们设计制备岩藻多糖多功 能 基因载体递送miRNA， 不仅能够能够实现miRNA的靶向递送， 其作为免疫激活剂， 还 可改善免 疫抑制的肿瘤微环境。 这种设计将为癌症的治疗提供新的治疗策略。 发明内容 [0005]本发明的目的在于提供一种多功能基因载体负载抗肿瘤活性的miRNA， 以实现 miRNA在体内的靶向运输及miRNA和岩藻多糖的协同抗癌作用。 [0006]本发明的具体技 术方案如下： [0007]一种多功能基因载体。 该纳米颗粒包括聚乙烯亚胺(Polyethyleneimine， PEI)修 饰的Fe3O4纳米磁核和组装在外层的岩藻多糖。 岩藻多糖 通过静电吸附自组装的方式结合至 磁核外层。 该 载体的的平均粒径为5 0～150nm。 [0008]本发明提供了上述多功能基因载体的制备 方法， 包括以下步骤： [0009]将10～15 mmol无水氯化铁， 优选为 15mmol， 3～5 mmol氢氧化钠， 优选为5mmol， 45～ 55mL乙二醇， 优选为50mL和3.6mL无菌水混合均匀后转移到三口瓶中， 加热至沸腾， 随后保 持沸腾回流8h～12h， 停止反应， 冷却至室温， 经磁性分离、 洗涤得到F e3O4纳米颗粒， 备用； [0010](2)三聚磷酸钠的交联和聚乙烯亚胺(PEI)修饰 [0011]将步骤(1)得到的四氧化三铁纳米颗粒分散于 无菌水中， 加入 三聚磷酸钠， Fe3O4纳说　明　书 1/6 页 3 CN 115120736 A 3