(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210754613.9 (22)申请日 2022.06.29 (71)申请人 上海市生物医药技 术研究院 地址 200032 上海市徐汇区斜土路2140号 (72)发明人 倪晓华　吴奇涵　张素芬　贺婉红　 陈静　祝海军　 (74)专利代理 机构 北京棘龙知识产权代理有限 公司 11740 专利代理师 苗冠军 (51)Int.Cl. C12N 15/113(2010.01) C12N 15/115(2010.01) A61K 31/7105(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 核酸适体-DNA 甲基化酶调控miRNA嵌合体、 制备方法及应用 (57)摘要 本发明公开了一种核酸适体 ‑DNA甲基化酶 调控miRNA嵌合体、 制备方法及应用， 所述核 酸适 体‑DNA甲基化酶调控miRNA嵌合体中包含有 PSMAAptamer(A10 ‑3)‑miR‑145的核苷酸序列， 所 述PSMA Aptamer(A10 ‑3)‑miR‑145的核苷酸序列 用于靶向识别前列腺癌细胞， 调控靶基因表达并 改变DNA甲基化修饰。 通过上述方式， 本发明将前 列腺特异性膜抗原 定位(PSMA 定位)的RNA核 酸适 体(PSMA Aptamer)与DNA甲基化酶调控miRNA进 行嵌合， 能够特异性结合表达PSMA的前列腺癌 (PCa)细胞， 同时具有与靶标分子亲和 力强、 特异 性高、 易于制备、 免疫原性和毒 性低、 化学结构稳 定等优势， 为前列腺癌提供潜在的靶向治疗药 物。 权利要求书1页 说明书7页 附图2页 CN 115109778 A 2022.09.27 CN 115109778 A 1.一种核酸适体 ‑DNA甲基化酶调控miRNA嵌合体， 其特征在于， 所述核酸适体 ‑DNA甲基 化酶调控miRNA嵌合体中包含有PSMA  Aptamer(A10 ‑3)‑miR‑145的核苷酸序列， 所述PSMA   Aptamer(A10 ‑3)‑miR‑145的核苷酸序列用于靶向识别前列腺癌细胞， 调控靶基因表达并改 变DNA甲基化 修饰。 2.根据权利要求1所述的核酸适体 ‑DNA甲基化酶调控miRNA嵌合体， 其特征在于， 所述 PSMA Aptamer(A10 ‑3)‑miR‑145的核苷酸序列为： A10‑3(2’ ‑Fluoro‑pyrimidi ne,and deoxy‑T 3’ ‑3’cap modificati ons) GGGAGGACGAUGCG GAUCAGCCAUGUUUACGUCACUC CUUGUCAAUCCUCAUCGGC miR145(anti  sense) AGGGAUUCCUGGGAAAACUGGACUU miR145(sense) ‑link A10‑3 5′ ‑GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCUGCCGAUGAGGAUU‑3′。 3.一种核酸适体 ‑DNA甲基化酶调控miRNA嵌合体的制备方法， 其特征在于， PSMA   Aptamer(A10 ‑3)‑miR‑145嵌合体的制备步骤 包括： S1： 将每个Aptamer及RNA  oligo溶解在无菌的DEPC水中， 使得终浓度为10 0u mol/L； S2： 将样本结合分组； S3： 将适体 ‑miRNAs混合物于95℃， 5mi n短暂变性， 然后放置在冰上冷却； S4： 退火的嵌合体在 ‑20℃下保存。 4.根据权利 要求3所述的核酸适体 ‑DNA甲基化酶调控miRNA嵌合体的制备方法， 将步骤 S2中的样本进行分组， 组1： (A10 ‑3‑miR145)： A10 ‑3/miR145(sense) ‑link A10‑3/miR145 (anti sense)； 组2： (Con miRNA)： Neg  aptamer/miR 145(sense) ‑link Neg/miR145(anti  sense)； 组3： (A10 ‑3‑con)： A10‑3/Con miRNA(sense) ‑link A10‑3/Con miRNA(anti  sense)； 其中， 组1形成样品1、 组2形成样品2、 组3形成样品3 。 5.根据权利 要求4所述的核酸适体 ‑DNA甲基化酶调控miRNA嵌合体的制备方法， 将起始 浓度为10 0u mol/L的样品1、 样品2和样品3， 各 取10ul， 置 于无RNA酶的八连 管中。 6.根据权利 要求5所述的核酸适体 ‑DNA甲基化酶调控miRNA嵌合体的制备方法， 在八连 管中加70ul的DEPC水， 形成终浓度为10u  mol/L的PSMA Aptamer(A10 ‑3)‑miR‑145嵌合体。 7.核酸适体 ‑DNA甲基化酶调控miRNA嵌合体的应用， 其特征在于， 所述PSMA  Aptamer (A10‑3)‑miR‑145用于抑制前列腺癌细胞的增殖。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115109778 A 2核酸适体 ‑DNA甲基化酶调控miRNA嵌合体、 制备方 法及应用 技术领域 [0001]本发明涉及一种前列腺癌治疗药物和方法， 属于生物医药应用领域， 特别是涉及 核酸适体‑DNA甲基化酶调控miRNA嵌合体、 制备 方法及应用。 背景技术 [0002]前列腺癌是目前全球男性发病率第二高的恶性肿瘤， 居男性癌症死因的第五位， 我国前列腺癌发病率也呈明显上升趋势。 研究估计， 2015年我国新发男性前列腺癌病例约 为7.2万， 世界人口标化发病率为6.47/10万， 中国人口标化发病率为6.59/10万； 约有3.1万 例死亡病例， 世界人口标化死亡率为2.65/10万， 中国人口标化死亡率为2.61/10万。 在全国 肿瘤登记地区中， 前列腺癌位于目前中国男性泌尿生殖系统恶性肿瘤发病第一位， 高于膀 胱癌。 [0003]前列腺癌的发病机制较为复杂,目前认为遗传和表观遗传机制共同作用导致前列 腺癌的发生、 发展， 其中表观遗传在前列腺癌的形成 中起到重要的作用。 采用雄激素阻断治 疗(androgen  ablation  therapy， AD T)是当前 公认的治疗手段。 然而， 在经过 1.5至2年的雄 激素阻断治疗有效期后， 几乎所有的患者均进展为对去势 不敏感前列腺癌阶段， 即 “去势抵 抗性前列腺癌 ”。 目前的医学研究进展对于激素抵抗性或者 晚期前列腺癌还缺乏有效的治 疗手段， 因此进一 步研究其发病机制尤其是表 观遗传学非常必要。 [0004]DNA甲基化谱式的紊乱是肿瘤细胞基因组的重要特征之一。 在肿瘤包括前列腺癌 中基因组DNA整体水平低甲基化广泛存在。 目前已经报道一些前列腺癌相关基因启动子区 甲基化异常促使癌症发生， 最常见的是抑癌基因启动子DNA 高甲基化。 癌症中DNA甲基化的 异常被认为与DNA甲基化酶系统的异常表达有关， 这个系统包括DNMT1， DNMT3A， DNMT3B和 UHRF1等。 DNMTs和UHRF1的高表达在大部分肿瘤中都普遍存在， 并且与肿瘤的发生密切相 关。 然而， 现在对于UHRF1以及其 他DNMTs在肿瘤 细胞中高表达的原因还不是非常清楚。 [0005]MicroRNA是一种含20 ‑22bp碱基的小非编码RNA。 据估计， 人类基因中的30％都是 受到miRNA的调控。 作为广泛的基因表达调控因子， microRNA能参与影响许多细胞生命活 动， 比如细胞周期， 增殖， 凋亡， 分化和发育。 miR ‑145位于5号染色体， 约覆盖4.09kb的区域， 被发现在前列腺癌中低表达， 影响细胞增殖、 迁移和侵袭能力， 表达受其自身启动子区甲基 化调控。 之前的研究发现miR ‑145通过调控DNMT1、 DNMT3B和UHRF1影响DNA甲基化修饰， 进而 能抑制前列腺癌、 卵巢癌等多种肿瘤细胞增殖。 因而mi R‑145可作为前列腺癌一种潜在的有 前途的新的治疗 药物， 但是目前面临的一个主要挑战是如何特异性将 MicroRNA 导入特定细 胞， 即靶向导入。 [0006]利用核酸适体(Aptamer， 一种稳定的核酸靶 向分子)实现靶向输送是目前正在发 展的一个方法。 Apt amer与靶蛋白结合的作用方式与抗体大致相同， 且具有高结合性， 易于 制备， 不引起免疫反应等优点。 前列腺特异性膜抗原(Prostate ‑Specific  Membrane   Antigen， PSMA)是前列腺癌细胞高表达的膜蛋 白， 为美国FDA批准的前列腺癌分子靶标。 我 们前期研发的前列腺特异性膜抗原定位(PSMA定位)的RNA核酸适体(PSMA  Aptamer)， 可特说　明　书 1/7 页 3 CN 115109778 A 3