(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210757593.0 (22)申请日 2022.06.30 (71)申请人 温州医科 大学附属第一医院 地址 325000 浙江省温州市瓯海区南白象 (72)发明人 上官福根　蓝林华　马能芳　 (74)专利代理 机构 重庆信必达知识产权代理有 限公司 5 0286 专利代理师 李小伟 (51)Int.Cl. C12Q 1/02(2006.01) G01N 33/68(2006.01) A61K 31/473(2006.01) A61P 1/18(2006.01) A61P 35/00(2006.01) G01N 15/14(2006.01)G01N 1/30(2006.01) (54)发明名称 一种6-Me生物碱在抗肿瘤中的应用 (57)摘要 本发明提供一种6 ‑Me生物碱在抗肿瘤中的 应用， 涉及抗肿瘤技术领域。 该6 ‑Me生物碱在抗 肿瘤中的应用通过6 ‑Me诱导死亡抑制胰腺癌恶 性表型的生物学活性研究、 6 ‑Me激活RI  PK1/ Caspase进而诱导细胞死亡的关键作用、 6 ‑ME激 活RI PK1/GSDME进而 诱导细胞焦亡的关键作用、 6‑ME对胰腺癌细胞线粒体功能的影响分析、 6 ‑ME 通过靶向丙酮酸羧化酶PCB影响草酰乙酸OAA代 谢引发ROS依赖的线粒体紊乱的分子机理探讨、 6‑ME靶向丙酮酸羧化酶诱导草酰乙酸代谢失衡 进而激活ROS/RI  PK1依赖的细胞死亡的内在机 制探究阐明了博落回这一传统中药的药理学活 性提供新的依据， 为后续靶向草酰乙酸代谢干预 胰腺癌提供了潜在的策略。 权利要求书4页 说明书11页 附图12页 CN 115058484 A 2022.09.16 CN 115058484 A 1.一种6‑Me诱导死亡抑制胰腺癌恶性表型的生物学活性研究， 其特征在于， 具体包括 以下步骤： S1测定细胞浓度 将胰腺癌细胞系， 即Patu ‑8988、 PANC ‑1、 ASPC‑1及CFPAC ‑1， 接种于96孔细胞培养板中， 次日， 加入浓度梯度6 ‑ME进行处理48hr， 按10 μL/孔加入CCK ‑8试剂， 37℃孵育2hr， 于450nm 测定OD值， 并绘制细胞活力曲线， 计算 不同时间点的IC50； S2测定细胞生长 将上述胰腺癌细胞系接种于RTCA细胞培养板中， 培养过夜， 加入相应浓度的6 ‑ME进行 处理， 测定细胞生长曲线； S3细胞克隆实验 将细胞按1000细胞/孔接种于六孔板中， 于37℃细胞培养箱中进行培养， 待长出肉眼可 见的克隆细胞团后， 加入浓度梯度6 ‑ME进行处理， 完成后， 将细胞应用甲醇于室温进 行固定 15min， 接着用结晶紫染色液于室温染色20mi n， 后用去离 子水漂洗， 进行拍照并计数； S4测定细胞 死亡 收集vehicle和6 ‑ME处理后的胰腺癌细胞， 用预冷的PBS重悬后收集细胞沉淀， 加入适 量AnnexinV ‑PE/7‑AAD染料进行染色， 于流式细胞仪进行分析， 着重分析细胞在各象限中的 分布情况。 2.一种6‑Me激活RIPK1/Caspase进而诱导细 胞死亡的关键作用， 其特征在于， 具体包括 以下步骤： ①测定作用浓度初步明确6 ‑ME可能介导的程序性细胞 死亡PCD 将胰腺癌细胞系Patu ‑8988及CFPAC ‑1接种于96孔细胞培养板中， 次日， 加入6 ‑ME以及 其他程序性细胞死亡PCD抑制剂， 共培养24hr， 按10 μL/孔加入CCK ‑8试剂， 37℃孵育2hr， 于 450nm测定OD值， 分析6 ‑ME可能介导的死 亡方式； ②测定相关指标 收集vehicle和6 ‑ME处理后的胰腺癌细胞， 应用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定样本蛋白 质浓度， 并结合Western  Blot检测细胞死亡相关指标的变化， 着重分析PARP、 Caspase ‑1、 Caspase‑3、 Caspase ‑4、 Caspase ‑5、 Caspase ‑6、 Caspase ‑7、 Caspase ‑8、 Caspase ‑9等分子的 活化水平； ③测相关信号轴指标 收集vehicle和6 ‑ME处理后的胰腺癌细胞， 应用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定样本蛋白 质浓度， 并结合Western  Blot检测RIPK1 ‑MLKL信号轴相关指标的变化， 着重分析p ‑RIPK1、 p‑MLKL的变化； ④测共培养后指标 收集vehicle， 6 ‑ME处理以及6 ‑ME与NEC‑1共培养后的胰腺癌细胞， 应用BCA蛋白浓度测 定试剂盒测定样本蛋白质浓度， 并结合Western  Blot检测细胞死亡相关指标的变化， 着重 分析PARP、 Caspase ‑3、 Caspase ‑8的活化情况； ⑤流式测细胞 死亡 收集vehicle， 6 ‑ME处理以及6 ‑ME与NEC‑1共培养后的胰腺癌细胞， 用预冷的PBS重悬后 收集细胞沉淀， 加 入适量AnnexinV ‑PE/7‑AAD染料进行染色， 于流式细胞仪进行分析， 着重权　利　要　求　书 1/4 页 2 CN 115058484 A 2分析细胞在各象限中的分布情况。 3.一种6‑ME激活RIPK1/GSDME进而诱导细 胞焦亡的关键作用， 其特征在于， 具体包括以 下步骤： 1)测定焦亡指标 集vehicle和6 ‑ME处理后的胰腺癌细 胞， 应用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定样本蛋白质 浓度， 并结合 Western Blot检测细胞焦亡相关指标的变化， 着重分析GS DME的活化水平； 2)一次LDH释放检测 通过LDH释放检测， 用微 孔读板仪在490nm检测所有样本的吸光 值； 3)拍照记录变化 将vehicle和6 ‑ME处理后的胰腺癌细胞于Leica倒置显微镜下进行观察， 并拍照， 记录 细胞形态学变化； 4)测定焦亡指标 收集vehicle， 6 ‑ME处理以及6 ‑ME与NEC‑1共培养后的胰腺癌细胞， 应用BCA蛋白浓度测 定试剂盒测定样本蛋白质浓度， 并结合Western  Blot检测细胞焦亡相关指标的变化， 着重 分析GSDME的活化水平； 5)二次LDH释放检测 同2)相同步骤进行LDH释放检测并且在6 ‑ME处理时， 需对6 ‑ME与NEC‑1共培养24hr的细 胞孔， 药物处 理样品孔， 并做好标记； 6)记录细胞 形态变化 收集vehicle， 6 ‑ME处理以及6 ‑ME与NEC‑1共培养后的胰腺癌细胞于Leica倒置显微镜 下进行观察， 并拍照， 记录细胞 形态学变化。 4.根据权利要求3所述的一种6 ‑ME激活RIPK1/GSDME进而诱导细胞焦 亡的关键作用， 其 特征在于： 所述2)中LDH释放检测具体步骤如下： (一).根据细胞的大小和生长速度将适量细胞接种到96孔细胞培养板中， 使待检测时 细胞密度不超过80 ‑90％； (二).吸去培养液， 用PBS液洗涤一次， 换新鲜培养液， 将各培养孔分成如下几组： 包括 无细胞的培养液孔， 未经药物处理的对照细胞孔， 未经药物处理的用于后续裂解的细胞孔， 以及6‑ME处理24hr的细胞孔， 并做好标记， 到预定的检测时间点前1小 时， 从细胞培养箱里 取出细胞培养板， 在 “样品最大酶活性对照孔 ”中加入试剂盒提供的LD H释放试剂， 加入量为 原有培养液体积的10％， 加入LDH释放试剂后， 反复吹打数次混匀， 然后继续在细胞培养箱 中孵育； (三).到达预定时间后， 将细 胞培养板用多孔板离心机400g离心5min， 分别取各孔的上 清液120 μL， 加入到一新的96孔板相应孔中， 期间配置反应工作液， 随即每孔加入60 μL配置 好的工作液， 混匀后室温孵育30min， 避光操作最后用微孔读板仪在490nm检测所有样本的 吸光值。 5.一种6‑ME对胰腺癌细胞线粒体功能的影响分析， 其特 征在于， 具体包括以下步骤： (1)细胞氧耗率对比 应用生物能量代谢仪分析对照组及6 ‑ME处理组细胞氧耗率的差异； (2)测线粒体膜电位权　利　要　求　书 2/4 页 3 CN 115058484 A 3