(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210771494.8 (22)申请日 2022.06.30 (71)申请人 中国人民解 放军陆军 军医大学第一 附属医院 地址 400038 重庆市沙坪坝区高滩岩正 街 30号 (72)发明人 刘宇奇　罗敏　平轶芳　时雨　 张志仁　卞修武　 (74)专利代理 机构 北京同恒源知识产权代理有 限公司 1 1275 专利代理师 廖曦 (51)Int.Cl. C12N 5/10(2006.01) C12N 15/55(2006.01) A61K 35/15(2015.01)A61P 35/00(2006.01) A61K 31/4188(2006.01) A61K 9/08(2006.01) (54)发明名称 敲除Dicer的单核细胞、 组合物及其在制备 治疗胶质母细胞瘤药物中的应用 (57)摘要 本发明提供一种敲除Dicer基因的单核细 胞、 组合试剂及其在制备治疗胶质母细胞瘤药物 中的应用。 所述单核细胞来源于巨噬细胞条件性 Dicer基因敲除小鼠的高表达Ly6C骨髓源性细 胞， 制备方法包括： A.提取巨噬细胞条件性Dic er 基因敲除小鼠骨髓源性细胞并标记磁珠； B.单核 细胞分选。 所述组合试剂由独立包装的Dicer基 因敲除的单核细胞注射液和替莫唑胺注射液组 成。 所述应用是将Dicer基因敲除的单核细胞注 射液和替莫唑胺注射液先后依次注射入胶质母 细胞瘤原位移植瘤小鼠体内。 本发 明向胶质母细 胞瘤荷瘤鼠输入敲除了Dic er基因的单核细胞使 得荷瘤鼠生存期显著延长， 促进了巨噬细胞吞噬 肿瘤细胞， 且增强了替莫唑胺(TMZ)对胶质母细 胞瘤的治 疗效果。 权利要求书1页 说明书10页 附图2页 CN 115109755 A 2022.09.27 CN 115109755 A 1.一种Dicer基因敲除的单核细胞， 其特征在于， 所述单核细胞来源于巨噬细胞条件性 Dicer基因敲除小鼠的高表达Ly6 C骨髓源性细胞。 2.根据权利要求1所述Dicer基因敲除的单核细胞的制备 方法， 其特 征在于， 包括 步骤： A.提取巨噬细胞 条件性Dicer基因敲除小鼠骨髓源性细胞并标记磁珠； B.单核细胞分选 。 3.根据权利要求2所述的制备 方法， 其特 征在于， 所述A包括 步骤： 1)使巨噬细胞 条件性Dicer基因敲除小鼠的骨髓形成细胞 悬液； 2)通过Ficoll分离法富 集所述小鼠骨髓源性细胞 悬液中的单个核细胞； 3)用含有单核细胞封闭液的PBS将细胞稀释为5 ×108个细胞/ml； 4)按体积比， 细胞悬液： CD11b磁珠分选抗体＝9:1， 在细胞悬液中加入磁珠抗体， 将细 胞悬液充分混匀， 于冰上孵 育20min； 5)用PBS洗涤细胞后， 用1ml  PBS重悬备用。 4.根据权利要求2所述的制备 方法， 其特 征在于， 所述B包括 步骤： 6)将所需LS型细胞分选柱同时放于QuadroMACS磁铁上， 在所述 LS柱下方放置离心管； 7)将权利要求3获得的所述PBS细胞重悬 液依次加在各LS型细胞分选柱上分选； 8)分选获得的细胞沉淀用体积比1:200的流式抗体Ly6C ‑APC/Cy7重悬， 通过流式分选 Ly6C高表达的细胞； 9)离心后将细胞用PBS重悬， 调整细 胞浓度至2000个细胞/ μl， 得到所述Dicer基因敲除 的单核细胞 悬液。 5.根据权利要求1所述Dicer基因敲除的单核细胞在制备治疗胶质母细胞瘤药物中的 应用。 6.根据权利要求5所述的应用， 其特征在于， 将Dicer基因敲除的单核细胞悬液从尾静 脉注射入胶质母细胞瘤小鼠体内， 每0.015 ‑0.02kg体重的小鼠注射2000个细胞/ μl的细胞 悬液80‑120 μl。 7.一种组合试剂， 由独立包装的Dicer基因敲除的单核细胞注射液和替莫唑胺注射液 组成。 8.根据权利 要求7所述的组合试剂， 其特征在于， 所述单核细胞注射液为2000个细胞/ μ l的PBS细胞悬液； 所述替莫唑胺注射液为4 ‑6％DMSO、 28 ‑33％PEG和ddH2O， 按顺序依次添加 溶解获得。 9.根据权利要求7 所述的组合试剂在制备治疗胶质母细胞瘤药物中的应用。 10.根据权利要求9所述的应用， 其特征在于， 所述Dicer基因敲除的单核细胞注射液和 替莫唑胺注射液先后依次注射入胶质母细胞瘤小鼠体内； 所述单核细胞注射液从尾静脉注 射入胶质母细胞瘤小鼠体内， 每0.02kg小鼠注 射2000个细胞/ μl的细胞悬液80 ‑120 μl； 所述 替莫唑胺 注射液腹腔注射入胶质母细胞瘤小鼠体内， 每小鼠注射 替莫唑胺10mg/kg。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115109755 A 2敲除Dicer的单核细胞、 组合物及其在制备治疗胶质母细胞瘤 药物中的应用 技术领域 [0001]本发明涉及药物制剂技术领域， 具体涉及一种D icer基因敲除的单核细胞、 组合试 剂及 其在制备治疗胶质母细胞瘤药物中的应用。 背景技术 [0002]胶质母细胞瘤是最常见的颅内原发性恶性肿瘤， 复发率高、 患者预后极差。 胶质母 细胞 瘤的生长依赖于特殊的肿瘤微环境。 巨噬细胞是胶质母细胞瘤微环境中数量最多的 免疫细胞，  因其表型和生物学功能异于正常巨噬细胞， 故被称作胶质瘤相关巨噬细胞。 研 究表明， 胶质  瘤相关巨噬细胞主要 呈现促肿瘤表型， 可通过促进胶质瘤细胞增殖、 侵袭、 血 管生成和胶质  瘤干细胞自我更新等恶性生物学行为， 进而促进胶质瘤生长和演进。 在胶质 瘤微环境中， 胶 质瘤相关巨噬细胞的炎性活化与吞噬功能被显著抑制， 深入研究胶质瘤相 关巨噬细胞表型调  控的机制， 找出调控其表型 的方法或将为提高胶质母细胞瘤患者生存 质量、 延长罹患胶质母  细胞瘤患者的生存期带来 新希望。 [0003]借助10×genomics单细胞转录组测序技术， 科学家们发现胶质母细胞瘤内存在多 个功能 各异的胶质瘤相关巨噬细胞亚群， 分别为高表达Sepp1的巨噬细胞亚群、 缺氧相关 的巨噬细  胞亚群、 具有增殖特性的巨噬细胞亚群、 高表达I  FN的巨噬细胞亚群与具有 吞噬 活性的巨噬 细胞亚群等。 其中， 高表达Sepp1的 巨噬细胞亚群与缺氧相关的 巨噬细胞亚群 高表达Mrc1、  Arg1等抗炎细胞因子基因， 可能具有促肿瘤效应； 高表达I  FN的巨噬细胞亚 群与具有 吞噬活 性的巨噬细胞亚群则具备炎性活化与吞噬潜能， 可能具有抗肿瘤效应。 该 研究显示： 提高具  有抗肿瘤效应潜能的巨噬细胞亚群比例， 和/或降低具有促肿瘤 效应潜 能的巨噬细胞亚群比  例， 可能作为靶向胶质母细胞瘤巨噬细胞的精准治疗手段。 [0004]Dicer是核糖核酸内切酶家族的一员， 位于细胞质， 能剪切pre ‑miRNAs进而促进绝 大部 分miRNAs的成熟。 miRNAs通过竞争性结合靶基因的3 ’ ‑UTR端抑制基因转录， 发挥调控 各 种细胞生理活动的作用。 在巨噬细胞内， Dicer显著影响miRNA ‑125、 let‑7b等miRNAs的 表 达量， 进一步影响巨噬细胞的炎性活化状态， 从而影响慢性炎症等多种疾病的进展。 因 此， 敲除Dicer基因的单核细胞有望改善胶质瘤相关巨噬细胞炎性活化状态。 [0005]将敲除Dicer基因的单核细胞、 组合试剂用 于胶质母细胞瘤临产治疗， 尚未有报 道。 发明内容 [0006]有鉴于此， 为了克服现有技术的不足， 本发明提供一种敲除Dicer基因的单核细 胞、 组 合试剂及其在制备治疗胶质母细胞瘤药物中的应用。 [0007]本发明提供的一种敲除Dicer基因的单核细胞， 所述单核细胞来源于巨噬细胞条 件性 Dicer基因敲除小鼠的高表达Ly6 C骨髓源性细胞。 [0008]上述Dicer基因敲除的单核细胞的制备 方法， 包括 步骤：说　明　书 1/10 页 3 CN 115109755 A 3