(19)国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202210762895.7 (22)申请日 2022.07.01 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 114836380 A (43)申请公布日 2022.08.02 (73)专利权人 依科赛生物科技(太 仓)有限公司 地址 215434 江苏省苏州市太 仓市浮桥镇 安江路66号 (72)发明人 林家会　马士棋　陈旭　陈刚　 (74)专利代理 机构 上海九泽 律师事务所 313 37 专利代理师 蔡佳杰 (51)Int.Cl. C12N 5/0783(2010.01) A61P 35/00(2006.01)审查员 崔娟娟 (54)发明名称 一种增强NK细胞对肿瘤细胞杀伤力的组合 物及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种增强NK细胞对肿瘤细胞 杀伤力的组合物及其应用， 组合物包括羧甲基 β‑葡聚糖钠、 白藜芦醇、 特丁基对苯二酚和茴 香 霉素。 本发明含有的羧甲基β ‑葡聚糖钠具有特 殊的分子结构， 能特异性激活NK细胞， 可提高NK 细胞的免疫应答， 从而显著提高NK细胞的杀伤 性。 本发明含有的特丁基对苯二酚和茴香霉素参 与NK细胞的转录调控， 促进 NK细胞杀伤蛋白的表 达， 显著提高NK细胞毒 性， 含有羧甲基β ‑葡聚糖 钠、 白藜芦醇、 特丁基对 苯二酚、 茴香霉素的组合 物培养的NK细胞杀伤性能优异， 在维持原有 NK细 胞高活率、 高扩增倍数、 高纯度的同时， 可将培养 14天的NK细胞在10:1效靶比的条件下对K562细 胞杀伤率 提高至少20%。 权利要求书1页 说明书7页 附图9页 CN 114836380 B 2022.10.21 CN 114836380 B 1.一种增强NK细胞对肿瘤细胞杀伤力的组合物， 其特征在于： 所述组合物包括羧甲基 β‑葡聚糖钠、 白藜 芦醇、 特丁基对苯二 酚和茴香霉素； 所述组合物中羧甲基β ‑葡聚糖钠的终浓度 为10‑200ng/mL， 白藜芦醇的终浓度为1 ‑15 μ M， 特丁基对苯二 酚的终浓度为0.1 ‑5 μM， 茴香霉素的终浓度为0.0 5‑0.5 μM； 所述组合物培 养NK细胞时， 包括以下步骤： 步骤一： 分离PBM C细胞； 步骤二： 将分离好的PBMC细胞悬液转移至培养瓶中， 使用NK细胞培养基调整细胞密度 为2×106个/mL， 放入培 养箱内进行细胞激活； 步骤三： 细胞激活后第三天， 将激活后的细胞转入新的培养瓶中， 再次加入NK细胞培养 基， 进行培养， 培养第三 天开始加入 该组合物继续进 行培养， 继续培养至第14 天得到处理后 的NK细胞。 2.根据权利要求1所述的一种增强NK细胞对肿瘤细胞杀伤力的组合物， 其特征在于： 所 述组合物 中羧甲基β ‑葡聚糖钠的终浓度为50ng/mL， 白藜芦醇的终浓度为5 μM， 特丁基对苯 二酚的终浓度为1 μM， 茴香霉素的终浓度为0.1 μM 。 3.根据权利要求1所述的一种增强NK细胞对肿瘤细胞杀伤力的组合物， 其特征在于： 所 述步骤二和步骤三中， NK细胞培养基由基础培养基、 IL ‑2、 IL‑15和热灭活自体血浆组成， 所 述IL‑2的终浓度为1000IU/mL， IL ‑15的终浓度为50ng/mL， 热灭活自体血浆的添加比例为 10％。 4.根据权利要求3所述的一种增强NK细胞对肿瘤细胞杀伤力的组合物， 其特征在于： 所 述基础培养基为SCGM培养基、 Corning  KBM581淋巴细胞无血清培养基、 Takara  NK细胞无血 清培养基中的一种。 5.根据权利要求1所述的一种增强NK细胞对肿瘤细胞杀伤力的组合物， 其特征在于： 所 述步骤三培养过程中每2天进 行一次细胞 活率、 密度的检测， 根据检测结果补液维持细胞密 度为1‑1.5×106个/mL。 6.根据权利要求1所述的一种增强NK细胞对肿瘤细胞杀伤力的组合物， 其特征在于： 所 述步骤二中培 养箱为5％二氧化 碳培养箱， 且所述培 养箱内部的温度为37℃。 7.根据权利要求1所述的一种增强NK细胞对肿瘤细胞杀伤力的组合物， 其特征在于： 所 述步骤一中采用密度离心法从人全血中新鲜分离PBM C细胞。 8.根据权利要求1所述的一种增强NK细胞对肿瘤细胞杀伤力的组合物， 其特征在于： 所 述步骤二中培 养瓶使用前包被了单 克隆CD16抗体。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114836380 B 2一种增强NK细胞对肿瘤细胞杀伤力的组合物及其应用 技术领域 [0001]本发明涉及细胞培养技术领域， 具体为一种增强NK细胞对肿瘤细胞杀伤力的组合 物及其应用。 背景技术 [0002]自然杀伤细胞， 即NK细胞 （Natur alKillerCell） ， 是与T细胞、 B细胞齐名却又不同 于两者的一类淋巴细胞， 同时对人体内的T淋巴细胞及B淋巴细胞具有一定的调节作用。 NK 细胞是与特异性免疫应答无关的一类免疫细胞， 细胞表型特征CD 3‑CD56+， 它所介导的细胞 裂解不受主要组织相容性复合体 （MHC） 的影响， 而且NK细胞根据其CD56分子表达的密度的 差异， 将NK分为CD56dim和CD56bright两个亚群， CD56dim占NK细胞的90％以上， 主要为细胞毒作 用， 具有很强 的杀伤活性； CD56bright可产生大量细胞因子， 主要起免疫调节作用。 NK细胞杀 伤活性受细胞表面多种受体调控： 杀伤细胞活化受体(KAR)和杀伤细胞抑制受体(KIR)。 正 常情况下， KAR与自身细胞上多糖类抗原结合产生活化信号， 同时KI R与MHCI类 分子结合， 产 生抑制信号且占主导地位， 以保证自身组织细胞不被破坏； 当细胞表面MHCI类分子发生改 变或减少缺失， 影响与KIR结合， 不能产生抑制性信号， NK则活化， 产生杀伤效应。 NK细胞主 要通过细胞毒活性来清除肿瘤细胞或病毒感染的细胞， NK细胞发挥细胞毒活性主要通过以 下机制： (1)NK细胞表面的Fc受体(CD16， FcRIIIγ)能与抗体结合， 发挥抗体依赖的细胞毒 (ADCC)作用从而杀伤相应的靶细胞； (2)NK细胞通过释放穿孔素和颗粒酶等细胞毒性颗粒， 裂解肿瘤细胞； (3)活化NK细胞表达FasL与靶细胞表面结合， 或通过表达TNF ‑a传递死亡信 号， 诱导靶细胞进入程序死 亡。 [0003]但通过目前的几种手段培养获得的NK细胞存在以下问题： （1） 添加可溶性重组生 长因子、 IL ‑2、 IL‑15等常规NK细胞培养方法获得的NK细胞， 存在杀伤活性不高的缺点； （2） 利用K562作为NK细胞扩增培养时的滋养层细胞获得的NK细胞杀伤活性一般且不符合GMP标 准。 发明内容 [0004]本发明的目的在于提供一种增强NK细胞对肿瘤细胞杀伤力的组合物及其应用， 以 解决上述背景技 术中提出的问题。 [0005]为了解决上述技术问题， 本发明提供如下技术方案： 一种增强NK细胞对肿瘤细胞 杀伤力的组合物， 所述组合物包括羧甲基β ‑葡聚糖钠、 白藜芦醇、 特丁基对苯二酚和茴香霉 素。 [0006]在一个优选的实施方式中， 所述组合物中羧甲基β ‑葡聚糖钠的终浓度为10 ‑ 200ng/mL， 白藜芦醇的终浓度为1 ‑15 μM， 特丁基对苯二酚的终浓度为0.1 ‑5 μM， 茴香霉素的 终浓度为0.0 5‑0.5 μM。 [0007]在一个优选的实施方式中， 所述羧甲基β ‑葡聚糖钠的浓度为50ng/mL， 白藜芦醇的 浓度为5 μM， 特丁基对苯二 酚的浓度为1 μM， 茴香霉素的浓度为0.1 μM 。说　明　书 1/7 页 3 CN 114836380 B 3