ICS 65.020 B 16 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 2724—2015 甘蔗脱毒种苗生产技术规程 Technique regulation for virus-free plantlet production of sugarcane 行业标准信息服务平台 2015-05-21发布 2015-08-01实施 中华人民共和国农业部 发布 NY/T2724—2015 前言 本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草 本标准由中华人民共和国农业部提出并归口。 本标准起草单位：浙江省农业科学院。 本标准主要起草人：陈剑平、陈志、汪一婷、牟豪杰、吕永平。 行业标准信息服务平台 I NY/T2724—2015 甘蔗脱毒种苗生产技术规程 1范围 本标准规定了甘蔗脱毒种苗的术语和定义、脱毒种苗生产、甘蔗种苗病毒检测种类及方法、种苗包 装、运输等要求。 本标准适用于甘蔗脱毒种苗生产。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 NY/T1796甘蔗种苗 NY/T2306花卉种苗组培快繁技术规程 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3. 1 甘蔗脱毒种苗 sugarcane virus-free plantlet 经检测确定不携带指定病毒的甘蔗种苗。 3. 2 组培瓶苗in-agarplantlet 生长在固体培养基（凝固剂一般为琼脂）中的组培生根苗。 3. 3 无琼脂苗 ex-agarplantlet 从培养容器中取出并洗去表面培养基的组培生根苗。 标准信息服务 3. 4 穴盘苗plugplantlet 穴盘中移栽成活的甘蔗组培苗 4脱毒种苗生产流程 4.1无菌材料的获得 4.1.1外植体材料的选择 选择具有待生产品种典型性状、无明显病虫害、品种纯正的健壮植株，切取顶芽及饱满带节间腋芽。 4.1.2外植体处理、消毒及接种 4.1.2.1外植体处理 顶芽及带节间腋芽切成约1cm×1cm×1cm大小的块状，剥去外面2层～3层包被鳞（叶）片。 4.1.2.2清洗 预处理好的外植体，用洗洁精溶液浸泡并振荡10min～20min，然后在自来水下流水冲洗15min~ 20 min。 4.1.2.3乙醇溶液处理 NY/T 2724—2015 在准备好的超净台上，将清洗后的外植体转移到无菌锥形瓶中，倒入70%～75%乙醇溶液没过外 植体表面1cm，轻摇锥形瓶以除去植物材料表面气泡，30s～60s后将酒精倒去，用无菌水冲洗外植体 3次。 4.1.2.4次氯酸钠处理 用有效氯浓度0.5%～1.0%的次氯酸钠溶液浸泡经乙醇溶液处理的植物材料，浸泡过程中不断轻 摇锥形瓶以除去外植体表面气泡，10min～15min后，倒出次氯酸钠溶液，植物材料用无菌水清洗 3次～5次后备用。 4.1.2.5氯化汞处理 经70%~75%乙醇溶液处理的植物材料也可用0.1%氯化汞溶液代替次氯酸钠溶液进行表面消 毒，浸泡时间为8min～10min，后续清洗同次氯酸钠处理。 4.1.2.6外植体接种 在超净工作台上取出灭过菌的接种盘，在接种盘内放置1张2张无菌滤纸，用冷却、无菌的接种 器械将经过表面消毒的植物材料取出（每次取3个～5个），放在无菌滤纸上吸干材料表面水分，然后将 外植体接入外植体萌发培养基（参见附录A），1瓶接种1个外植体，封口。 4.1.3外植体培养 接种完成后统一贴上标签，注明品种、接种日期、接种培养基等信息，放在组培用托盘内，送人培养 室进行培养，培养温度控制在（25土3)℃，光照强度25umol·m-2s-1~40μmol·m-2·s-，光照时 间每天不低于12h，培养期间及时去除被污染材料。 4.2不定芽诱导和增殖 4.2.1不定芽诱导 由4.1得到的高约1.5cm2.5cm的无菌、成活芽萌发材料，在无菌工作台上从芽基部与母体分 离，然后接种在不定芽诱导培养基中，培养环境同4.1.3。 4.2.2不定芽增殖 由4.2.1获得增殖良好的簇生甘蔗培养材料，在无菌工作台上以3个～4个不定芽为接种单位从 基部进行分离（芽高度控制在2.0cm～3.0cm），然后接种在不定芽增殖培养基中，培养环境同4.1.3。 每25d~30d继代1次。 4.3茎尖培养 4.3.1材料选择 选择经由4.2.2连续培养获得的健壮、无菌不定芽。 4.3.2茎尖剥离 在无菌条件下，将簇生不定芽从基部单个分离，并自芽基部以上0.5cm左右处切断，选取芽基部分 进行茎尖剥离。在体视镜下用无菌解剖刀小心逐层剥离外层叶鞘，直至露出长约0.3mm0.5mm的 茎尖，然后更换为无菌且未使用过的解剖刀将茎尖从母体材料切下，立即接种于茎尖伸长培养基中。 4.3.3茎尖伸长培养 将4.3.2接种好的甘蔗茎尖置于（23土3)℃，光照强度10μmol·m.s-~20μmol·m-2·s-1 光照时间每天不低于12h。 4.3.4不定芽诱导 茎尖伸长生长至1.5cm～2.0cm后即可接种到不定芽诱导培养基中，培养环境同4.1.3。对每一 个成活茎尖材料进行编号。 4.3.5再生材料增殖 将4.3.4获得的不定芽接种到不定芽增殖培养基中，培养环境同4.1.3。每25d～30d继代1次。 4.4茎尖培养再生植株病毒检测 2 NY/T 2724—2015 4.4.1检测病毒种类 本标准检测病毒包括甘蔗花叶病毒（Sugarcanemosaicvirus，SCMV）、高梁花叶病毒（Sorghum mosaicvirus，SrMV），甘蔗黄叶病毒（Sugarcaneyellowleafvirus，SCYLV）和甘煎杆状病毒（Sugar cane bacilliform virus,SCBV)。 4.4.2材料选择 茎尖培养再生材料增殖到10株～15株后，按照4.3.4的要求对应编号，选取叶片为检测材料，对 每个编号株系的茎尖再生材料进行病毒检测。 4.4.3检测方法 检测方法参见附录B。检测所需仪器设备及试剂参见附录C。 4.4.4脱毒材料确认 连续3代检测均同时不携带4种检测病毒的甘蔗组培材料即被确认为脱毒材料（不定芽）。 4.4.5不合格材料处理 不合格材料在未打开培养瓶情况下经121℃、101kPa灭菌30min后再废弃。 5脱毒不定芽扩繁 5.1脱毒不定芽扩繁 经4.4.4确认的脱毒不定芽按照4.2.2的方法进行增殖。 5.2脱毒不定芽保存 脱毒不定芽扩繁材料可移至（18士2)℃，光照强度20μmol·m-²·s-l~30umol·m-².s-1，光照 时间10h～12h环境中进行长期保存。每90d继代1次，可继代保存12代～15代。 6生根诱导 到生根诱导培养基中，培养环境同4.1.3。 7炼苗、移栽及管理 7.1炼苗时期 室外温度为10℃～30℃之间均适合甘蔗组培苗移栽。 7.2基质准备及消毒 将不同基质按一定比例混配均匀，装入穴盘中并稍压紧，用0.5g/L的多菌灵（80%可湿性粉剂）溶 液浸透后捞出或喷透备用。 7.3组培苗炼苗 7.3.1炼苗标准 培养瓶内甘燕组培苗高≥5cm，基部长出6条～10条1cm～1.5cm长的白色不定根，即可进行 炼苗。 7.3.2炼苗 温室中，培养瓶在自然环境条件下培养3d～7d。 7.4移栽 轻轻取出组培苗，放人清水中（水温18℃～20℃），组培苗洗干净表面培养基后稍晾干，然后栽于装 好基质的穴盘中，覆盖物或基质以刚盖过组培苗基部为宜，稍压实，以幼苗不倒即可，移栽好的穴盘分品 种、移栽日期，在苗床上整齐摆放。 7.5管理 3 NY/T 2724—2015 7.5.1水肥管理 移栽2周～4周内，相对湿度控制在75%～90%，当第一片新叶完全张开后，逐渐降低湿度。 4周~6周后，相对湿度保持在60%~85%，光照强度控制在60μmol·m=2：s-1~100μmolm-2. s1。移栽第4周～8周内，每隔7d喷施液肥一次，移栽8周后，视植株生长情况酌情施肥 7.5.2病虫害防治 移栽4周后，每周喷施75%百菌清可湿性粉剂或80%多菌灵可湿性粉剂1000倍~1250倍液1 次；移栽8周后，追施2.8%阿维菌素乳剂2000倍液防治线虫。温室内宜均匀悬挂黄色诱虫板，悬挂高 度应高于穴盘苗15cm，密度以每20m²悬挂1张25cm×40cm大小的诱虫板为宜。 8种苗质量要求和检查判断规则 8.1种苗类型 种苗类型包括组培瓶苗、无琼脂苗和穴盘苗。 8.2抽样方法及数量 据NY/T1796，不同种苗类型脱毒种苗检测采取随机抽样，不同样品抽样数量见表1其中组培瓶 苗以瓶为单位，无琼脂苗和穴盘苗以株为单位。 表 1 抽样数量 种苗数量 抽样数量 不超过1000 20 不超过5000 40 不超过10000 60 超过10000 80 8.3判定规则 8.3.1整体要求 据NY/T2306，种苗株形丰满、完整、粗壮、挺直有活力，叶色正常，根系发达、健壮，整齐度95%以 上，无污染及典型病虫害症状。 8.3.2质量标准 据NY/T1796，脱毒种苗按质量要求分一级和二级，低于二级的脱毒种苗不应作为商品苗，不同类 型脱毒种苗等级规格划分见附录D。 8.4不合格苗处理 病毒检测不合格的，组培瓶苗处理方法同4.4.5，无琼脂苗和穴盘苗一律采用焚烧方式处理。 9包装、标签及运输 9.1包装 9.1.1一般情况下，种苗包装过程中需保湿，防挤压、倒置，包装盒内温度保持10℃25℃。 9.1.2如客户或订单有明确要求，应按照客户或者订单要求进行包装。 9.2标签 包装箱上应贴上标签，