ICS 65.020 B 16 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 2719-2015 苹果苗木脱毒技术规范 Technical regulation for eliminating viruses from apple nursery plant 行业标准信息服务平台 2015-05-21 发布 2015-08-01实施 中华人民共和国农业部 发布 NY/T2719—2015 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国果品标准化技术委员会（SAC/TC510）归口。 本标准起草单位：中国农业科学院果树研究所、农业部果品及苗木质量监督检验测试中心（兴城）、 辽宁省果蚕管理总站。 本标准主要起草人：董雅凤、张尊平、胡国君、范旭东、任芳、宣景宏、周俊。 行业标准信息服务平台 I NY/T2719—2015 苹果苗木脱毒技术规范 1范围 本标准规定了苹果苗木脱毒的术语和定义、脱除病毒种类和脱毒方法。 本标准适用于苹果栽培品种和砧木品种的脱毒。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 NY/T2281苹果病毒检测技术规范 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3. 1 苹果试管苗appleplantletinvitro 通过组织培养方法获得的无菌瓶装苹果离体植株。 3. 2 热处理thermotherapy 将盆栽苗或试管苗置于光照培养箱或人工气候室内，在较高恒温或变温条件下生长，以抑制病毒在 植株体内增殖和扩散，从而获得无病毒新梢或茎尖组织的过程。 4脱除病毒种类 ASPV）、苹果褪绿叶斑病毒（Applechloroticleafspotvirus，ACLSV）、苹果花叶病毒（Applemosaic virus，ApMV)和苹果锈果类病毒（Applescarskinviroid,ASSVd)。 5脱毒方法 5.1器材 5.1.1超净工作台：洁净度为100级@≥0.5μm 5.1.2高压灭菌锅：最高工作压力为0.142MPa； 5.1.3光照培养箱：温度可调范围为0℃~50℃； 5.1.4体视显微镜：放大倍数为6.5X~45×； 5.1.5pH计：测量精度为±0.05pH； 5.1.6电子天平：感量为0.0001g。 5.2盆栽苗热处理 2月～3月，将前一年移栽或嫁接成活的苹果盆栽苗移入温室，待萌芽后，放人光照培养箱或人工气 候室内，进行恒温热处理，（37土2)℃处理30d，或变温热处理，（32士2)℃和（38士2)℃每隔8h变换一 次，处理60d。每天光照12h以上，光照强度为5000lx～10000lx。热处理结束后，立即剪取新梢顶端 进行嫩梢嫁接（5.4)或茎尖培养（5.5）。 1 NY/T2719—2015 5.3试管苗热处理 试管苗于25℃~28℃继代培养10d～15d置光照培养箱中（32土2)℃恒温培养5d后，进行恒温热 处理或变温热处理（5.2），每天光照12h以上，光照强度15001x20001x。为防止培养基干燥，热处理 前在无菌条件下加入少量灭菌的1/2MS液体培养基。热处理结束后，立即从试管苗上剥取茎尖进行 培养（5.5）。 5.4嫩梢嫁接 5.4.1嫩梢嫁接 从热处理结束的盆栽苗上，剪取长约1.0cm～2.0cm的新梢顶端，采用皮下嫁接或劈接方法嫁接 到长势良好的无病毒实生砧木或营养系木上。 皮下嫁接：将木苗顶部剪平，用刀片在干皮自上而下划一切口，将热处理顶梢削成楔形，插在砧木 韧皮部与木质部之间。 劈接：在砧木主茎或分枝顶端半木质化时，用刀片削平顶端，在截面中间向下纵切0.5cm～1.0cm， 将顶梢削成楔形，插人切口之中。 5.4.2嫁接植株管理 嫁接后用封口膜或塑料薄膜包扎，套上塑料袋保温保湿，置于18℃25℃环境中，注意遮阳，加强 肥水管理，促进嫁接苗成活。7d～10d后，如果嫁接顶梢未萎為，除去保湿的塑料袋，生长6个月以后， 进行病毒检测。 5.5茎尖培养 5.5.1培养基制备 MS基本培养基、分化增殖培养基和生根培养基制备方法参见附录A。 5.5.2茎尖分离培养 5.5.2.1盆栽苗热处理 从热处理的盆栽苗上，采集生长旺盛、长约1cm～2cm的顶梢，去掉叶片，在超净工作台上进行消 毒处理。先用75%乙醇溶液浸泡30s，无菌水冲洗后放人0.1%氯化汞溶液中消毒5min~7min，无菌 水浸洗3次～5次，取出置于无菌培养皿上，在解剖镜下剥取小于0.3cm的茎尖，接种在分化增殖培养 基上。 5.5.2.2试管苗热处理 从热处理的试管苗上取顶梢，置于无菌培养血上，在解剖镜下剥取小于0.3cm的茎尖，接种在分化 增殖培养基上。 5.5.3试管苗增殖培养 将接种的培养瓶置于25℃～28℃、光照强度10001x～20001x、每天光照12h的组培室中培养。根 据生长状况，每1个～2个月转接1次，转接时，先将试管苗基部愈伤组织切除，再切成带1个～2个腋 芽的茎段，接种在增殖培养基上。由同一个茎尖增殖得到的组培苗为一个芽系，统一编号。继代培养5 次～6次，同一芽系的试管苗数量达到5瓶以上时，进行病毒检测。享 5.6病毒检测 嫩梢嫁接和茎尖培养获得的所有植株和试管苗均需进行病毒检测，确认是否脱除了本标准规定的 所检病毒。检测方法按NY/T2281的规定执行。 5.7脱毒结果判定 未检测到本标准规定的脱除病毒种类，且末表现任何病毒病症状，生长和结果性状符合该品种特 性，则作为无病毒原种材料保存。 2 NY/T 2719—2015 附录A （资料性附录） 苹果组培培养基制备 A.1常用溶液配制 除特别说明外，溶液均用蒸馏水溶解和定容，各种母液配制完成后，分别用玻璃瓶贮存，并贴上标 签，注明母液号、配制倍数和日期等，置于4℃冰箱保存。制备培养基用的母液和植物生长调节剂溶液 应尽快使用，保存期不超过4个月。 A.1.1MS培养基母液配制 I号母液（1000mL） 取蒸馏水200mL~300mL，依次加入82.5g硝酸铵（NHNO）、95.0g硝酸钾（KNO3）、8.5g磷 酸二氢钾（KH2PO），每加一种试剂，即搅拌溶解，最后定容至1L。 Ⅱ号母液（500mL） 取蒸馏水200mL~300mL，依次加入310.0mg硼酸（HBO）845.0mg硫酸锰（MnSO·H2O）、 430.0mg硫酸锌（ZnSO4·7HzO)、41.5mg碘化钾（KI)、12.5mg钼酸钠（NazMo0·2H2O)、1.25mg 硫酸铜（CuSO·5HzO）、1.25mg氯化钻（CoCl²·6H,O），每加种试剂，即搅拌溶解，最后定容至500 mL. Ⅲ号母液(500mL) 称取22.0g氯化钙（CaCl2·2HzO)，用蒸馏水溶解，定容至500mL。 V号母液（500mL) 称取18.5g硫酸镁（MgSO47H2O），用蒸馏水溶解，定容至500mL。 V号母液（500mL) 称取1.865g乙二胺四乙酸二钠（Na2-EDTA）和1.39g硫酸亚铁（FeSO4·7HzO)，分别溶解后混 合，定容至500mL，放入棕色系口瓶中，室温放置10h以上，然后放人4℃冰箱保存。 V号母液（500mL） 取蒸馏水200mL~300mL，依次加人5.0g肌醇（Myo-inositol)、25.0mg维生素B、25.0mg烟酸 （Nicotinicacid）、5.0mg维生素Br、100.0mg甘氨酸，每加一种药品，即搅拌溶解，最后定容至500ml。 A.1.2生长调节剂 称取吲哚乙酸（IAA）20mg，用1mL~2mL95%乙醇溶液溶解，然后加蒸馏水定容至200mL，配成 1mg/10mL的贮存溶液。赤霉素（GA，）、吲哚丁酸（IBA）和萘乙酸（NAA)配制方法同上。称取6- 基腺嘌呤（6-BA)20mg，用1.0mol/L盐酸溶液溶解，然后加蒸留水定容至200mL，配成1mg/10ml 的贮存溶液。 A.1.31.0mol/L盐酸溶液和1.0mol/L氢氧化钠溶液(调整pH用) 1.0mol/L盐酸溶液：量取8.4mL盐酸，定容至100mL。 1.0mol/L氢氧化钠溶液：称取4.0g氢氧化钠，溶解后定容至100mL。 A.2制备培养基 A.2.1培养基种类 分化增殖培养基：MS（每1L培养基量取I号母液20mL，量取IⅡ、Ⅲ、IV、V、V号母液各10mL)附 3 NY/T 2719—2015 加赤霉素（GA，)0.1mg/L～0.5mg/L、吲哚丁酸（IBA)0.1mg/L~0.5mg/L、6-苄基腺嘌呤（BA） 0.5mg/L~1.0mg/L、蔗糖30g/L、琼脂5g/L 生根培养基：1/2MS（每1L培养基量取I号母液10mL，量取IⅡ、Ⅲ、IV、V、V号母液各5mL）附 加吲哚丁酸(IBA)0.1mg/L~0.3mg/L或吲哚乙酸(IAA)0.2mg/L~1.0mg/L、蔗糖15g/L、琼脂 5 g/ L。 A.2.2培养基制备 I.根据所需培养基种类和数量依次吸取I号～V号母液，例如配1/2MS培养基2L，则加入I号 母液20ml，Ⅱ号～V号母液各10mL。 Il.加人生长调节剂。例如，6-芊基腺嘌呤（BA)的使用浓度为1.0mg/L，则配2L培养基加人 20.0mL浓度为1.0mg/10mL的BA溶液。 Il：加蒸馏水定容，充分混匀，用1.0mol/L盐酸溶液或1.0mol/L氢氧化钠溶液调pH至5.6~ 5. 8。 IV.稍加热，即放人琼脂，待其溶化后，加人