ICS 65.020 B 16 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 2743—2015 实时 甘蔗白色条纹病菌检验检疫技术规程 荧光定量PCR法 Technical regulations for inspection and quarantine of Xanthomonas albilineans (Ashby )Dowson-Real time PCR method 行业标准信息服务平台 2015-05-21发布 2015-08-01实施 中华人民共和国农业部发布 NY/T 2743—2015 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由农业部种植业管理司提出。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271）归口。 本标准起草单位：农业部福建甘蔗生物学与遗传育种重点实验室、农业部甘蔗及制品质量监督检验 测试中心、国家甘蔗工程技术研究中心。 本标准主要起草人：许莉萍、王恒波、阙友雄、黄国强、郭晋隆、苏亚春。 行业标准信息服务平台 I NY/T 2743—2015 甘蔗白色条纹病菌检验检疫技术规程 实时荧光定量PCR法 1范围 本标准规定了甘蔗白色条纹病菌实时荧光定量PCR检测方法。 本标准适用于甘蔗种茎、种苗以及甘蔗或其他植物组织中的甘蔗白色条纹病菌（Xanthomonasal- bilineans）的检验检疫与检测。本标准中PCR等缩略语参见附录A。甘蔗白色条纹病菌有关信息参见 附录B。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T28067甘蔗黄叶病毒实时荧光RT-PCR检测方法 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3. 1 hrpB基因hrpBgene 植物病原细菌的一种过敏性反应和致病性基因（hypersensitivereactionandpathogenicitygene， hrp）参与和介导过敏性反应（hypersensitiveresponse，HR）的发生，与植物病原细菌致病性密切相关。 hrpB基因是甘蔗白色条纹病菌的特异致病基因，编码细菌的类型Ⅲ蛋白分泌系统（typeⅢproteinse- cretion system，TTSS），通过该分泌途径，将细菌产生的诱导植物致病的蛋白，释放到胞外或宿主细胞 中，从而诱发宿主的各种效应。 4原理 利用荧光信号伴随着目标序列PCR扩增产物的增加而增强的原理，通过收集PCR扩增过程的荧 光信号值，即可判断试样是否带有日标序列。为此，在克隆甘蔗白色条纹病菌特异性致病基因hrpB全 长序列基础上，根据序列信息设计了PCR引物与探针，筛选获得特异性引物与探针，建立了一种基于 hrpB基因检测甘蔗白色条纹病菌的实时荧光定量PCR方法 5试剂 除非另有规定，在分析中仅使用分析纯试剂，实验用水符合GB/T6682的二级水指标，其中涉及 PCR的用水要求达到一级水指标。 5.1氢氧化钠（10mol/L)溶液：在160mL水中加人80gNaOH，溶解后加水定容至200mL，塑料瓶中 保存。 5.2EDTA溶液（500mmol/L，pH8.0)：称取二水乙二铵四乙酸二钠（NazEDTA·2H,O)18.6g，加 人70mL水中，加热至完全溶解后，冷却至室温，用10mol/LNaOH溶液调pH至8.0，加水定容至100 mL。在121℃条件下灭菌20min。 5.3Tris-HCl溶液（1mol/L，pH8.0)：称取121.1g三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶解于800mL水中， 用浓盐酸调pH至8.0，加水定容至1000mL。在121℃条件下灭菌20min。 1 NY/T 2743—2015 5.4TE缓冲液(pH8.0)：分别加人Tris-HCI(pH8.0)10mL和EDTA(pH8.0)溶液2mL,加水定 容至1000mL。在121℃条件下灭菌20min。 5.5Tris-HCl(1mol/L,pH7.5)溶液：称取121.1gTris碱溶解于800mL水中，用浓盐酸调pH至 7.5，用水定容至1000mL。在121℃条件下灭菌20min。 5.6氯仿：异戊醇溶液：将氯仿和异戊醇按照24：1的体积比混合。 5.7CTAB裂解液（1000mL)：在600mL水中加人81.7g氯化钠，20g十六烷基三甲基溴化铵 （CTAB），20g聚乙烯吡咯烷酮（K30)（PVP），1gDIECA，充分溶解（需加热助溶），然后加人Tris-HCI (pH7.5）100mL，EDTA（pH8.0)4mL，加水定容至1000mL，室温保存，使用时加人0.2%（V/V）的 β-基乙醇。 5.8其他试剂：适用于实时荧光PCR反应TaqDNA聚合酶(5U/μL)及其反应缓冲液、2.5mmol/L dNTPs、异丙醇、75%乙醇(V：V)。 6仪器设备 6.1实时荧光定量PCR扩增仪：激发/检测波长范围350nm750nm；可用探针SYBRGreenI染料 和TaqMan探针；升降温速度≥2.0℃/s；均性+/一0.5℃；准确性+/一0.3℃；温度范围4℃~ 100℃。 6.2电泳仪：输出类型为恒压/恒流/恒功率输出；输出范围为10V~600V/1mA~500mA/1W~300 W；分辨率为电压1V、电流1mA、电功率1W；定时范围1min~5h以上。 6.3紫外分光光度计。 6.4低温冷冻离心机（4℃）。 6.5-80℃冰箱。 6.6微量加样器：0.5μL~10μL、5μL~20μL、20μL~200μL、200μL~1000μL。 7样品的采集与前处理 7.1采样 7.1.1采样工具：按GBT28067的要求执行。 7.1.2采样方法：按GB/T28067的要求执行。其中，叶片样品和蔗茎样品采集时首选可疑甘蔗病 株，蔗茎采回并去皮后，采用钳子直接挤压出汁5mL，蔗汁收集在5mL～10mL无菌离心管中，备 用。 7.1.3对照材料 阳性对照：用已知含甘蔗白色条纹病菌的样品或甘蔗白色条纹病菌纯培养物作为阳性对照。 服务平台 阴性对照：用已知不含甘蔗白色条纹病菌的样品作阴性对照。 空白对照：用无菌一级水代替样品。 7.2样品存放与运送 按GB/T28067的要求执行。 8操作方法 8.1样品DNA提取 在样品处理区进行。 8.1.1取n十2个1.5mL无DNA酶的离心管，其中n为待检样品数、1管阳性对照、1管阴性对照，对 每个管进行编号。 2 NY/T 2743—2015 5.4TE缓冲液(pH8.0)：分别加人Tris-HCI(pH8.0)10mL和EDTA(pH8.0)溶液2mL,加水定 容至1000mL。在121℃条件下灭菌20min。 5.5Tris-HCl(1mol/L,pH7.5)溶液：称取121.1gTris碱溶解于800mL水中，用浓盐酸调pH至 7.5，用水定容至1000mL。在121℃条件下灭菌20min。 5.6氯仿：异戊醇溶液：将氯仿和异戊醇按照24：1的体积比混合。 5.7CTAB裂解液（1000mL)：在600mL水中加人81.7g氯化钠，20g十六烷基三甲基溴化铵 （CTAB），20g聚乙烯吡咯烷酮（K30)（PVP），1gDIECA，充分溶解（需加热助溶），然后加人Tris-HCI (pH7.5）100mL，EDTA（pH8.0)4mL，加水定容至1000mL，室温保存，使用时加人0.2%（V/V）的 β-基乙醇。 5.8其他试剂：适用于实时荧光PCR反应TaqDNA聚合酶(5U/μL)及其反应缓冲液、2.5mmol/L dNTPs、异丙醇、75%乙醇(V：V)。 6仪器设备 6.1实时荧光定量PCR扩增仪：激发/检测波长范围350nm750nm；可用探针SYBRGreenI染料 和TaqMan探针；升降温速度≥2.0℃/s；均性+/一0.5℃；准确性+/一0.3℃；温度范围4℃~ 100℃。 6.2电泳仪：输出类型为恒压/恒流/恒功率输出；输出范围为10V~600V/1mA~500mA/1W~300 W；分辨率为电压1V、电流1mA、电功率1W；定时范围1min~5h以上。 6.3紫外分光光度计。 6.4低温冷冻离心机（4℃）。 6.5-80℃冰箱。 6.6微量加样器：0.5μL~10μL、5μL~20μL、20μL~200μL、200μL~1000μL。 7样品的采集与前处理 7.1采样 7.1.1采样工具：按GBT28067的要求执行。 7.1.2采样方法：按GB/T28067的要求执行。其中，叶片样品和蔗茎样品采集时首选可疑甘蔗病 株，蔗茎采回并去皮后，采用钳子直接挤压出汁5mL，蔗汁收集在5mL～10mL无菌离心管中，备 用。 7.1.3对照材料 阳性对照：用已知含甘蔗白色条纹病菌的样品或甘蔗白色条纹病菌纯培养物作为阳性对照。 服务平台 阴性对照：用已知不含甘蔗白色条纹病菌的样品作阴性对照。 空白对照：用无菌一级水代替样品。 7.2样品存放与运送 按GB/T28067的要求执行。 8操作方法 8.1样品DNA提取 在样品处理区进行。 8.1.1取n十2个1.5mL无DNA酶的离心管，其中n为待检样品数、1管阳性对照、1管阴性对照，对 每个管进行编号。 2 NY/T2743—2015 表2实时荧光定量PCR反应体系 终浓度 单样品体积 10×PCR缓冲液 1x 2.5μL 25 mmol/L MgCl 2.5mmol/L 2.5 μL dNTPs(各2.5mm