ICS 65.020 B 16 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 2744—2015 马铃薯纺锤块茎类病毒检测 核酸斑点杂交法 Detection of potato spindle tuber viroid(PSTVd)- Nucleic acid spot hybridization(NASH) 行业标准信息服务平台 2015-05-21发布 2015-08-01实施 中华人民共和国农业部 发布 NY/T2744-2015 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由农业部种植业管理司提出并归口。 本标准起草单位：农业部脱毒马铃薯种薯质量监督检验测试中心（哈尔滨）、中国农业科学院植物保 护研究所、黑龙江八一农垦大学。 本标准主要起草人：邱彩玲、刘尚武、张志想、吕典秋、白艳菊、李世访、王绍鹏、魏琪、董学志、耿宏 伟、万书明、金光辉、高艳玲、郭梅、闵凡祥、王亚洲、杨光辉、王晓丹、申宇、张威、范国权、张抒、宿飞飞、李 勇、胡林双、马纪、刘振宇、高云飞、杨帅、李学湛。 行业标准信息服务平台 I NY/T2744—2015 马铃薯纺锤块茎类病毒检测核酸斑点杂交法 1范围 本标准规定了马铃薯纺锤块茎类病毒（PotatoSpindleTuberViroid，PSTVd)的检测方法。 本标准适用于马铃薯的马铃薯纺锤块茎类病毒的检测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB7331马铃薯种薯产地检疫规程 GB18133马铃薯种薯 NY/T1962—2010马铃薯纺锤块茎类病毒检测 3原理 经过标记的PSTVd探针通过氢键与其互补的靶序列结合，洗去未结合的游离探针后，经放射自显 影或显色反应检测特异结合的探针，鉴定马铃薯组织是否感染PSTVd。 4试剂与材料 以下所用试剂，除特别注明者外均为分析纯试剂，水为符合GB/T6682中规定的一级水。 4.1CHCI（三氯甲烷）。 4.2正电荷尼龙膜（Hybond-N+）。 4.3抗地高辛-AP(Anti-Digoxigenin-AP)。 4.4CDP-Star(化学发光法使用）。 4.5X光片（化学发光法使用）。 4.6显影液、定影液（化学发光法使用）。 4.7Tween-20（Cs8H114O26，聚氧乙烯去山梨醇单月桂酸酯）。 4.8杂交液。市售。 4.910×阻断液。市售。 4.10提取缓冲液。在160.0mL蒸馏水中依次加人NaC111.7g、MgCl,0.4g、醋酸钠（CHCOONa） 8.21g、无水乙醇40.0mL和十二烷基磺酸钠（SodiumDodecylSulfate,SDS）6.0g，用HCI或NaOH 调节pH至6.0。 4.1120倍柠檬酸缓冲液储备液（20×SSC储备液）。在800mL水中加人NaCl175.3g、柠檬酸钠 88.2g，加人数滴10mol/LNaOH溶液调节pH至7.0,加水定容至1L，分装后高压灭菌。或者选择市 售商品。 4.1210%SDS。在80mL水中加人SDS10g，溶解后定容至100mL。 4.132×SSC/0.1%SDS。在35.6mL蒸馏水中加入20倍柠檬酸缓冲液储备液（4.11）4mL，10% SDS(4.12)400μL，混匀。 4.140.1×SSC/0.1%SDS。在39.4mL蒸馏水中加入20倍柠檬酸缓冲液储备液（4.11)200μL， 1 NY/T2744—2015 10% SDS(4.12)400μL,混匀。 4.15马来酸缓冲液。在800mL水中加入马来酸（顺丁烯二酸，CH,O）11.607g，NaCl8.77g，用 NaOH调pH至7.5(20℃），定容至1L,5℃~25℃稳定。 4.16洗涤缓冲液。在100mL马来酸缓冲液（4.15)中加人0.3mLTween-20（4.7)，混匀，5℃~25℃ 稳定。 4.175×检测缓冲液。在80mL水中加入Tris-HCI7.88g,NaCl2.92g,用HCI或NaOH调节pH 至9.5（20℃），定容至100mL。使用时用水稀释至1×工作液，5℃～25℃稳定。 4.18探针。参考吕典秋1或其他相关文献制备，或直接购买商品化的探针。 4.19阻断液。用马来酸缓冲液（4.15)稀释10×阻断液（4.9)，制成1X工作液。如：2mL10×阻断液 十18mL马来酸缓冲液，现用现配。 4.20抗体液工作液。每次使用前，需要10000r/min离心抗Dig-AP（4.3）5min，从表面小心吸取 所需的量，用阻断液按1：5000稀释抗体液。例如：2uL抗Dig-AP+10mL阻断液（4.9），2℃～8℃保 存，12h稳定。 4.21二甲基甲酰胺(C,H,NO,DMF) 4.22硝基蓝四氮唑（C4oH3oN1.O。·2Cl,NBT）储备液（化学显色法使用）。NBT30mg+DMF70% 1mL，4℃或一20℃保存备用。 4.23对甲苯胺蓝（BCIP）储备液（化学显色法使用）。BCIP15mg+DMF100%1mL，4℃或一20℃保 存备用。 4.24显色液（化学显色法使用）。加NBT储液（4.22)和BCIP储液（4.23)各10μL于1mL1×检测 缓冲液中，混匀，现用现配。 4.25发光底物（化学发光法使用）。10μLCDP-STAR(4.4）加人到1mL1X检测缓冲液中，混匀。 5仪器 5.1紫外交联仪。 5.2台式低温高速离心机（≥10000r/min，4℃）。 5.3杂交箱。 5.4水平摇床。 5.5微量移液器（0.5μL~10μL、10pL~100μL、20μl~200μ、100μL~1000μL）。 6分析步骤 6.1阴阳对照的设立 设立阳性对照和阴性对照。在以下实验过程中，要设立阴性、阳性对照，即标准的阳性样品和阴性 样品要同待测样品一同进行如下操作，阴阳对照的制备方法参见附录A。 6.2样品的采集和制备 样品采集按照GB18133和GB7331中的规定进行。 6.3样品RNA的提取 取0.2g样品放于研样袋或研钵中，加人0.3mL提取缓冲液（4.10），磨碎，转入1.5mL离心管中， 盖严盖，37℃孵育15min，加人等体积（0.3mL)的三氯甲烷（4.1)，振荡离心管或涡旋震荡使之彻底混 匀，直至出现乳状液，4℃，10000r/min离心5min，至溶液分离（上层水相，下层三氯甲烷，或把离心管 放在4℃冰箱过夜，分离RNA），吸出上清液，4℃保存，备用。 2 NY/T2744—2015 10% SDS(4.12)400μL,混匀。 4.15马来酸缓冲液。在800mL水中加入马来酸（顺丁烯二酸，CH,O）11.607g，NaCl8.77g，用 NaOH调pH至7.5(20℃），定容至1L,5℃~25℃稳定。 4.16洗涤缓冲液。在100mL马来酸缓冲液（4.15)中加人0.3mLTween-20（4.7)，混匀，5℃~25℃ 稳定。 4.175×检测缓冲液。在80mL水中加入Tris-HCI7.88g,NaCl2.92g,用HCI或NaOH调节pH 至9.5（20℃），定容至100mL。使用时用水稀释至1×工作液，5℃～25℃稳定。 4.18探针。参考吕典秋1或其他相关文献制备，或直接购买商品化的探针。 4.19阻断液。用马来酸缓冲液（4.15)稀释10×阻断液（4.9)，制成1X工作液。如：2mL10×阻断液 十18mL马来酸缓冲液，现用现配。 4.20抗体液工作液。每次使用前，需要10000r/min离心抗Dig-AP（4.3）5min，从表面小心吸取 所需的量，用阻断液按1：5000稀释抗体液。例如：2uL抗Dig-AP+10mL阻断液（4.9），2℃～8℃保 存，12h稳定。 4.21二甲基甲酰胺(C,H,NO,DMF) 4.22硝基蓝四氮唑（C4oH3oN1.O。·2Cl,NBT）储备液（化学显色法使用）。NBT30mg+DMF70% 1mL，4℃或一20℃保存备用。 4.23对甲苯胺蓝（BCIP）储备液（化学显色法使用）。BCIP15mg+DMF100%1mL，4℃或一20℃保 存备用。 4.24显色液（化学显色法使用）。加NBT储液（4.22)和BCIP储液（4.23)各10μL于1mL1×检测 缓冲液中，混匀，现用现配。 4.25发光底物（化学发光法使用）。10μLCDP-STAR(4.4）加人到1mL1X检测缓冲液中，混匀。 5仪器 5.1紫外交联仪。 5.2台式低温高速离心机（≥10000r/min，4℃）。 5.3杂交箱。 5.4水平摇床。 5.5微量移液器（0.5μL~10μL、10pL~100μL、20μl~200μ、100μL~1000μL）。 6分析步骤 6.1阴阳对照的设立 设立阳性对照和阴性对照。在以下实验过程中，要设立阴性、阳性对照，即标准的阳性样品和阴性 样品要同待测样品一同进行如下操作，阴阳对照的制备方法参见附录A。 6.2样品的采集和制备 样品采集按照GB18133和GB7331中的规定进行。 6.3样品RNA的提取 取0.2g样品放于研样袋或研钵中，加人0.3mL提取缓冲液（4.10），磨碎，转入1.5mL离心管中， 盖严盖，37℃孵育15min，加人等体积（0.3mL)的三氯甲烷（4.1)，振荡离心管或涡旋震荡使之彻底混 匀，直至出现乳状液，4℃，10000r/min离心5min，至溶液分离（上层水相，下层三氯甲烷，或把离心管 放在