ICS65.020 B 16 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 3059—2016 大豆抗孢囊线虫鉴定技术规程 Specification for identification of soybean resistance to cyst nematode 行业标准信息服务平台 2016-12-23 发布 2017-04-01实施 中华人民共和国农业部 发布 NY/T3059—2016 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草 本标准由农业部种子管理局提出并归口。 本标准起草单位：吉林省农业科学院。 本标准主要起草人：张金花、任金平、高月波、王义生、李启云、刘晓梅、张伟、王继春、姜兆远。 行业标准信息服务平台 I NY/T3059—2016 大豆抗孢囊线虫鉴定技术规程 1范围 本标准规定了大豆抗孢囊线虫的鉴定方法和评价标准。 本标准适用于大豆种质资源和品种对大豆孢囊线虫的抗性鉴定和评价。 2术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 2. 1 大豆孢囊线虫soybeancystnematode 一种土传、内寄生且能引起大豆叶部黄化和植株矮化症状的线虫，具体形态特征参见附录A。 2. 2 生理小种race 大豆孢囊线虫种内在形态上没有差别，但在大豆不同品种上具有显著致病性差异的群体，需要采用 一套鉴别寄主进行区分。 2. 3 鉴别寄主differentialhosts 用于鉴别和区分大豆孢囊线虫不同生理小种的一套带有不同抗性的大豆品种。 3试剂、材料和仪器设备 3.1基质 蛭石20目细沙。 3.2标准筛网 标准筛网一套，用于线虫孢囊、卵的过滤。 3.3其他用品 培养血、托盘、镊子、烧杯、三角瓶、漏斗、软胶棒、剪刀、滤纸、酒精灯、研钵、量筒、花盆等。 3.4显微镜 放大倍率：4倍～100倍，用于大豆孢囊线虫的形态鉴定及卵的显微镜计数。 3.5移液器 服务平台 量程：200uL~1000μL，系统误差：土1.2%，随机误差士0.6%。用于精确量取线虫卵悬浮液及 接种。 3.6高压灭菌锅 用于基质、试验用水及小型器具的消毒处理。 4鉴定方法 4.1田间病圃法 4.1.1播种 选择平均孢囊数大于30个的病圃，按品种适宜播期播种，每份材料2行，行长5m，每行留苗35 株～50株。根据试验量，每20个参鉴品种设一个感病对照。 1 NY/T3059—2016 4.1.2调查 大豆出苗后28d～35d，检测感病品种根部大豆孢囊线虫的发育情况。当大豆孢囊线虫白色雌虫 突出表皮时，随机挖取10株，统计根上的孢囊数 4.2病土盆栽法 4.2.1播种 选择平均孢囊数大于30个的病土，掺人30%消毒后的细沙，充分混匀，放人直径为18cm、高20cm 的花盆中，每盆播种大豆5粒，出苗后留苗3株，每个品种播5盆，同时设置感病对照，随机摆放，土壤采 用滴灌方式补充水分，含水量控制在50%~60 4.2.2调查 大豆出苗后28d~35d，检测感病品种根部大豆孢囊线虫的发育情况。 当大豆孢囊线虫白色雌虫 4.3人工接种法 4.3.1接种 高20 cm的花盆中备 采用无线虫孢 美的士 ·混合后火菌 用。供试大豆在灭菌的蛭石中育 ，挑选根系长 的幼苗移栽到花盆中。 移栽时，先在移栽位置每株接 1500粒列ml的孢囊线虫卵是浮液5ml 虫卵悬浮液的制备 重复·设置感病对照品种 鉴定在温室内完成 30℃。 A 4.3.2调查 350 测感病品种根部大豆孢囊线虫的发育情况。当大豆孢 移栽后28d 统计根 的囊数，对所有鉴定品种逐株调查全部株系 表皮时，扣盆调查 4.4重复鉴定 当田间病圆鉴 定为抗生以上时需进行2次室内人 步确定 5抗性评价 5.1有效性 当设置的对照品利 抗性评价标准 A 逐株调查根系上的抱囊数目，计算 进行分级 大豆对囊线！ 中的抗性分级标准 表1 级别 抗性评价 级标准 单株平均孢囊数为0个，值 生长正常 IM 1 单株平均孢囊数在0.1个 3.0个之间：植株 HR 3 单株平均孢囊数在3.1个～10.0个之间，植株生长基本正常或部分矮黄 R 5 单株平均孢囊数在10.1个～30.0个之间，植株矮小，叶片发黄结实少 s 7 HS 9 单株平均孢囊数在30.1个以上，植株不结实，干枯死亡 5.3抗性判断 根据重复抗性鉴定结果，以记载的最高发病程度，对鉴定材料进行抗病性评价，写出正式鉴定报告， 并附原始资料。大豆抗孢囊线虫鉴定调查汇总表见附录C 2 NY/T3059—2016 附录A （资料性附录） 大豆孢囊线虫及生理小种 A.1大豆孢囊线虫 A.1.1形态特征 大豆孢囊线虫（H） feroder 雌成虫柠檬形，先白后变黄 褐，大小0.85mm 0.51mm。 为两侧半膜孔型 和泡状突 。尾端略向腹侧弯曲，平均体长 雄成虫线形 明 1.24mm。卵长椭圆形， 明大小 108-2 uo幼 龄在卵内发育，脱皮成二 龄幼虫二龄 幼虫卵针形头 钝尾细 三龄幼虫腊肠状，生殖器开女 始发雌雄可辨。四龄幼虫在三龄 发育 不印掉蜕 说皮的外壳 孢囊线虫以卵，胚胎卵和少量幼虫个孢囊内于土壤中越冬，有的 幼虫旧皮中 粘附于种 冬，成为琴年初侵染源，囊角质层厚，在土廉 10 年以上。虫卵越冬 后，以二龄幼虫破壳进 人土中，遇大登幼苗根系侵人，寄生手根的皮层中 ，中针吸食，虫体露于其外。 雌雄交配后 雄虫死 雌虫体内形成卵粒，膜 变为抱囊。 中印孵化可再侵染。二龄线 抱囊落人十 虫只能侵害幼根 季温度下降 孵化 包囊内越冬。 卵不用 R 成虫产 适湿度60 0%，卵孵化温度16℃ 适温 0. 以24℃孵化率最高。 幼虫发育适 6℃以18℃～25℃最适， 幼虫漫大温店 低于 10℃件 停止活动。土壤 内线虫量大 发病重。连作田 病重 c A. 1. 2 大豆孢囊 线虫病 人叫大豆黄委病俗称“ 它是 豆腐害 三要大豆生产国的美 国、巴西、中 国利 要危售根部：被害植株 良矮 苗期感病后子叶和 真叶变黄，发 和黄茶 重者 全株枯死。病株根系不发 不结爽 达，侧根显著流 拔起病株观察 有许多白色或黄褐色小 颗粒，即孢囊线 A.2生理小种 A.2.1 生理小种鉴定 采用Golden(1970）确立的 鉴别寄主谱即Pia t、Png、PI88788、PI90763、Lee68五个品种 进行鉴定。用透明的塑料薄膜制成直 em的塑料钵柱，将平均孢囊数大于30个孢 囊的病土混匀装入。种子于蛭石中发芽，子叶即将展开时，选取根长一致的幼苗移栽到装有病土的塑料 钵柱中。每钵1株，每个鉴别寄主10钵，置于28℃温室恒温培养。移栽后28d~30d.拆开塑料钵柱， 拨开土柱，取全根系，统计根上和土壤中的孢囊总数，计算孢囊指数，按照表1的划分标准确定生理 小种。 A.2.2孢囊指数 鉴别品种根上平均孢囊数与感病对照品种根上平均孢囊数的比值.按式（A.1）计算孢囊指数，计算 结果保留两位小数。 T FI= X100 (A. 1) C 3 NY/T3059—2016 式中： T 供试品种的平均孢囊数，单位为个每株（个/株）； 感病对照品种的平均孢囊数，单位为个每株（个/株）。 C A.2.3 生理小种划分标准 大豆孢囊线虫生理小种划分标准见表A.1。 表A.1大豆孢囊线虫生理小种划分标准 线虫在鉴别寄主上的繁殖能力 生理小种 PI88788 PI90763 Lee68 Pickett Peking + + 1 + + 2 + + 一 一 + 3 + + + + + 4 + + 十 一 + 9 + 一 + + 7 一 + + + 8 + 6 + + + + + 10 + + 一 + 11 一 + + + 12 13 + 一 十 14 + + + + + + + 15 + + + 十 16 注：FI>10%时为感病（+）：F<10%时为抗病（-）。 行业标准信息服务平台 4 NY/T3059—2016 附录B （规范性附录） 线虫接种体制备 B.1病土采集 采自大豆孢囊线虫多发地区的大豆根系土壤。 B.2病土中孢囊的收集及测定 取病土50g，用筛孔直径为6mm的粗筛，筛去土块和草屑等杂物，然后放在1000mL的三角瓶中 或容量瓶中。瓶内加水700mL，震荡30s后，静置10min后，孢囊和草屑等都浮在四周的瓶壁上，立即 将上层漂浮物倒在50目的筛子上，冲洗以后将孢囊洗到铺有滤纸的漏斗上，滤去水分后将滤纸摊开晾 干检查。测定5份土样中每百克风干土中的孢囊数，平均孢囊数大于30个即可用于孢囊线虫的抗性 鉴定。 B.3孢囊线虫卵悬浮液的制备 将病土中或根系上收集到的孢囊放人研钵中用橡皮或软胶棒轻碾后加水过200目筛网，在500目 筛网收集卵，并配成200个卵/mL的卵悬浮液。 B.4繁殖 将含有不同生理小种的孢囊线虫的土壤，根据土壤黏性，加人30%消毒后的细沙，装人花盆中，种 植感病品种以繁殖线虫，获得大量用于接种的孢囊。 B.5保存 繁殖线虫后的病土装人塑料大盆或水泥池中，定时补充水分，上覆盖塑料薄膜，保持含水量在 业标准信息服务平台 60%~80%。 5