ICS 65.020 B 16 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 32572018 水稻稻瘟病抗性室内离体叶片 鉴定技术规程 Technical code of practice for wounding inoculation of detached leaves for evaluation of rice resistance to the blast fungus(Magnaporthe oryzae) 行业标准信息服务平台 2018-07-27发布 2018-12-01实施 中华人民共和国农业农村部发布 NY/T3257—2018 前 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草 本标准由农业农村部种植业管理司提出并归口。 本标准起草单位：全国农业技术推广服务中心、中国农业大学。 本标准主要起草人：赵文生、彭友良、杨普云、杨俊、朱晓明。 行业标准信息服务平台 I NY/T3257—2018 水稻稻瘟病抗性室内离体叶片鉴定技术规程 1范围 本标准规定了水稻对稻瘟病抗性的室内离体叶片鉴定技术方法和评价标准。 本标准适用于常规水稻资源、品种、品系等材料对稻瘟病抗性的室内鉴定和评价。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版不（包 所有的修改 GB/T15790稻瘟病测报调范围 GB/T19557.7 稳定性测试指 3术语和定义 L 3.1 resistance 抗病性 disease 植物体所具有的能减 轻或克服病原物致病作用的可遗传自 3. 2 人工接种 artifical inocnlation 操作将接种体置于植物 在适宜条件 通过人 3.3 抗性评价 evaluation of resistan 老病虫害反应程度和 的求 3.4 接种体inoculum 能够侵染寄主并引起病害的病原 3.5 水稻稻瘟病 the rice blast 由丝状真菌稻瘟病菌（有性态为Magnaportheoryzae无性态为Priculariaoryzae）引起的水稻 真菌病害。依据病害发生的时期和部位，稻瘟病可分为、叶盒、叶枕瘟、穗颈瘟、枝梗瘟、粒瘟和茎 节瘟。 3. 6 番茄燕麦培养基oattomatoagar 用于稻瘟病菌培养。称取40g燕麦片，800mL水煮沸留滤液，加入150mL番茄汁，15g琼脂粉 定容至1L。 4病原物的采集、分离和保存 4.1病样采集 在待测水稻材料的适合种植地区或拟推广地区代表性地块种植普感品种丽江新团黑谷，种植全程 1 NY/T3257—2018 不施用杀菌剂。在田间叶瘟发生期（一般为分期至抽穗扬花期），采集具有典型稻瘟病病斑的水稻 叶片。 4.2病菌分离 剪取含有单个典型病斑的水稻叶段，浸水展开，经次氯酸钠消毒和无菌水漂洗之后，用灭菌滤纸 吸干叶段上的水，平铺于水琼脂板上。于28℃光照培养箱中约5d，可观察到稻瘟菌的无性繁殖体 （包括营养菌丝、分生孢子梗和分生孢子）。在体视显微镜下，用挑针挑取叶段上的稻瘟菌分生孢子， 并置于含有四环素等抗生素的水琼脂板上，28℃光照培养箱中培养。12h～24h后，用挑针在体视显 微镜下挑取萌发的单个稻瘟菌分生孢子。含有单个稻瘟菌分生孢子的琼脂块要尽可能小，且背景干 净、无杂质。 4.3病菌培养 将挑取的单个稻瘟菌分生孢子块转移至番茄燕麦培养基上，于28℃光照培养箱中培养，3d～5d后 可长出稻瘟菌菌落。 4.4病菌保存 确认长出的稻瘟菌菌落生长良好，无杂菌污染。挑取菌落边缘的新生菌丝至贴有灭菌滤纸片的番 茄燕麦培养基上，于28℃光照培养箱中培养。待稻瘟菌菌落长满滤纸片（7d～9d），确认无杂菌污染 后，收集滤纸片于灭菌的硫酸纸袋内，编号，并于超净工作台内吹干。将装有稻瘟菌的硫酸纸袋放人灭 菌的信封内，于干燥器中干燥7d～10d；然后放置于盛有硅胶干燥剂的塑料盒内，于一20℃冰箱中长期 保存。每个病斑只分离、保存1个单抱菌株。 5水稻的种植与管理 根据需要称取适量的供试（待测）水稻种子，按常规方法种植水稻幼苗，待水稻生长至3叶～7叶龄 期用于接种。 6接种体的制备 稻瘟菌菌丝块或分生孢子悬浮液均可作为室内接种鉴定的接种体。 6.1菌丝块 从冰箱中取出保存的滤纸片，平铺在番茄燕麦培养基的中央部位，于28℃光照培养箱中培养。 5d～7d后，用菌落边缘的菌丝块作为接种体。在番茄燕麦培养基上转接培养的菌丝块也可作为接 种体。 6.2分生孢子悬浮液 6.2.1产孢 在番茄燕麦培养基上活化稻瘟菌，待其菌落直径长至接近培养基边缘时，在超净工作台内往培养血 中加人适量无菌水润湿菌落，片刻后用无菌的涂菌环将菌丝打断成细小碎段，用移液器将菌丝液混匀， 转移到新的厚番茄燕麦平板上（培养基厚度大于培养血厚度的2/3），再用同一无菌涂菌环涂布均匀，吹 干，于28℃光照培养箱中培养1.5d或2d左右，待番茄燕麦平板上长出气生菌丝.加无菌水到培养皿 中；用棉签将培养基表面菌丝轻轻擦去，避免损伤培养基表面；用水将菌丝段冲洗干净、晾干，再用双层 纱布盖在培养血上。28℃光照培养箱中培养2d～3d，培养基表面即可生成大量的分生孢子。 6.2.2制备孢子悬浮液 在产孢培养血上加人含0.025%Tween20的灭菌水，用玻璃洗菌棒将菌落表面形成的分生孢子洗 下，再用双层擦镜纸过滤分生孢子液至5mLEP管中。充分混匀分生孢子液，用血球计数板测定孢子 浓度。重复测定3次，取平均值。将分生孢子悬浮液浓度调至105个孢子/mL，且保证菌液不少于 2mL。分生孢子悬浮液需现配现用。 2 NY/T3257—2018 7离体叶片划伤接种 7.1叶片的准备 剪取充分展开心叶的中下部叶段（长度约为5cm），用灭菌的昆虫针在叶正面、垂直于主叶脉制造 微创伤，每个叶段均匀分布3个微创伤点，每个点长约2mm，注意不能划穿叶片。接种前准备盛放待测 水稻叶片的培养皿：将滤纸裁剪成直径约8cm的圆片，把2层～3层灭菌滤纸片平铺于直径为9cm的 塑料培养皿内，添加自来水浸湿滤纸片，去掉培养皿内的流动水。将2根灭菌牙签放人培养皿内用于搭 放水稻叶片，牙签间距2cm～3cm。注意叶面上的划伤点不要摆放在牙签上，防止孢子液的液滴滑落或 导致叶片易变黄。 7.2接种 接种前，先在划伤叶段上均匀喷洒含0.025%Tween20的灭菌水。 如以菌丝块为接种体，用打孔器或刀片在菌落近边缘处取0.5cm×0.5cm×0.5cm的菌丝块，倒 置于叶片划伤点上，轻压以使菌丝块充分接触叶面划伤部位。 如以分生孢子悬浮液为接种体，混匀孢子悬浮液后，用200μL的移液器在划伤点处点接5μL～10 μL孢子液滴，液滴太大易滑落，太小发病不充分。每个叶片3个接种点，3次独立重复。 7.3接种后处理 将含有接种水稻叶段的培养血先放置于相对湿度100%、26℃下，黑暗培养24h～36h；再将培养皿 摆放在26℃、光照条件下保湿培养，每天喷水1次～2次，观察叶片发病情况。根据发病情况，在接种后 96h~168h拍照、记录。 8抗病性评价 8.1抗感性判别 抗性病斑仅局限于叶片划伤处，呈褐色点状，病斑中无分生孢子形成，即为“十”。感病病斑呈梭形， 中央灰色的崩溃部生有菌丝和分生孢子，崩溃部的外围可能有褐色坏死，最外层是淡黄色的中毒部，形 状不规则，边缘呈现出暗绿色记为“一”。 8.2接种菌株的数量 室内评价待测水稻材料的抗瘟性，所用菌株须为从拟推广地区（建议以县或县级市为单位）种植 的普感品种丽江新团黑谷上分离的单孢菌株，菌株数量不少于300株/县或连续3年，每年不少于 100株。 8.3重复接种 对于第一次接种出现抗病病斑或不典型感病病斑的菌株，要再进行2次重复接种。3次接种均为 抗病病斑的记为“十”；3次接种中只要有一次出现感病病斑记为“一” 8.4接种有效性判别 每次接种均以普感品种丽江新团黑谷为对照，对照叶片上出现典型的感病病斑时，接种有效。 8.5抗谱计算 按式(1)计算。 C= (1) 式中： 形成抗病病斑的菌株数，单位为个； 6一一总接种菌株数，单位为个； C—一抗谱，单位为百分率（%）。 3 NY/T3257—2018 8.6 抗瘟性评价标准 依据待测材料的室内抗谱评价其在当地大田的抗性潜力，具体评价标准见表1。 表1水稻稻瘟病抗性的评价标准 抗性评价 评价标准（C)，% C>70 抗病Resistant(R) 中抗Moderatelyresistant(MR) 中感ModeratelySusceptible(MS) CK30 感病Susceptible(S) 服务平台 NY/T3257—2018 中华人民共和国 行业标准信息 农业行业标准 水稻稻瘟病抗性室内离体叶片鉴定技术规程 NY/T3257—2018 * 中国农业出版社出版 （北京市朝阳区麦子店街18号楼） （邮政编码：100125 网址：www.ccap.com.cn) 北京印刷一厂印刷 新华书店北京发行所发行各地新华书店经销 开本880mm×1230mm1/16 印张0.75 字数15千字 2018年11月第1版 2018年11月北京第1次印刷 书号：16109·4612 定价：18.00元 版权专有侵权必究 NY/T3257-2018 举报电话：（010）59194261