ICS07.100.99 CCSB41T/ZNZ 浙江省农产品质量安全学会团体标准 T/ZNZ163—2023 畜禽养殖场细菌耐药性水平评价技术规范 Technicalspecificationfortheassessmentofantibacterialresistance inlivestockandpoultryfarms 2023-01-18发布 2023-02-18实施 浙江省农产品质量安全学会发布 全国团体标准信息平台 T/ZNZ163—2023 I前  言 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起 草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由浙江省农产品质量安全学会提出并归口。 本文件起草单位：浙江省农业科学院农产品质量安全与营养研究所、浙江省动物疫病预防控制中心、 金华金婺农业发展有限公司、浙江国正检测技术有限公司。 本文件主要起草人：唐标、杨华、马剑钢、冯伟峰、代兵、汪建妹、肖英平、王小骊、周炜、陈洁、 吉小凤、阮紫涵、李锐、汪雯、关椿久、龙晓倩。 全国团体标准信息平台 T/ZNZ163—2023 1畜禽养殖场细菌耐药性水平评价技术规范 1范围 本文件规定了畜禽养殖场细菌耐药性水平评价的设备和材料、样品采集、菌株分离与药物敏感性试 验、评价对象、评价方法、记录和生物安全的要求。 本文件适用于猪、鸡、鸭等畜禽养殖场的大肠埃希菌和肠球菌（屎肠球菌或粪肠球菌）耐药性水平 评价。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB4789.1食品安全国家标准食品微生物学检验总则 GB4789.28食品安全国家标准食品微生物学检验培养基和试剂的质量要求 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB19489实验室生物安全通用要求 T/ZNZ044畜禽养殖环节细菌耐药性监测方法 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 细菌耐药性antibacterialresistance 细菌对抗菌药物不敏感的现象。 3.2 抗菌药物敏感性试验antimicrobialsusceptibilitytesting 检测细菌对抗菌药物的体外敏感性，以指导临床合理选用药物的微生物学试验。 3.3 最低抑菌浓度minimalinhibitoryconcentration，MIC 体外能够抑制肉眼可见的细菌生长的最低药物浓度，用以判断测试菌株对抗菌药物的敏感程度。 3.4 耐药率antibacterialresistancerate 全国团体标准信息平台 T/ZNZ163—2023 2在分离的一批菌株中，某种细菌对某种抗菌药耐药的菌株数占总菌株数的比例，常以百分率表示。 3.5 耐药强度系数antibacterialresistancecoefficient 根据细菌对抗菌药物的MIC值计算的养殖场中细菌的整体耐药程度。 3.6 多重耐药性multi-drugresistance 一株细菌对3类及以上抗菌药物同时具有耐药性的特性称为多重耐药性。 4设备和材料 4.1设备 微生物实验室常规灭菌及培养设备按GB4789.1执行，其他设备如下： ——微量移液器：0.1μL～2.5μL、1μL～10μL、10μL～100μL、100μL～1000μL； ——自动加样仪或多通道微量加样器：10μL～100μL； ——麦氏比浊仪：可测量范围0.01～4.00麦氏单位； ——恒温培养箱：36℃±1℃； ——低温贮藏箱：2℃～8℃； ——冰箱：2℃～8℃，－20℃，－80℃。 4.2材料 ——无菌培养皿：直径60mm或90mm； ——96孔透明无菌微孔板； ——1μL一次性无菌接种环、10μL一次性无菌接种环； ——一次性无菌采样拭子； ——标准比浊管； ——商品化药敏试验板。 4.3试剂 4.3.1实验用水 培养基和试剂配制用水应符合GB/T6682的规定。无菌生理盐水的制备按GB4789.1执行。 4.3.2培养基 4.3.2.1Carry-Blair转运培养基（Carry-BlairTransportMedium）及其制备按GB4789.28执行。 4.3.2.2LB（Luria-Bertani）琼脂平板及其制备按T/ZNZ044执行。 4.3.3质控菌株 4.3.3.1大肠埃希菌（Escherichiacoli）标准菌株ATCC25922，保存、传代等应按照GB4789.28的要 求执行。 4.3.3.2粪肠球菌（Enterococcusfaecalis）标准菌株ATCC29212，保存、传代等应按照GB4789.28的 要求执行。 全国团体标准信息平台 T/ZNZ163—2023 35样品采集 5.1采样 首先固定拟采样的畜禽动物，然后采样人员将蘸取少量生理盐水的拭子轻轻旋入畜类的肛门或禽 类的泄殖腔1cm～2cm，随后迅速将样品拭子放回含有转运培养基的运输管中。若有明确来源的新 鲜粪便也可用拭子蘸取采集。应及时填写采样单，采样单格式见附录A。 5.2保存与运输 采集的样品拭子应在2℃～8℃条件下冷藏，并于48h内送达检测单位；检测单位应在收到样 品24h内开展检测工作。 5.3采样数量 每个对象应以15个～30个拭子样品为宜。 6菌株分离与药物敏感性试验 菌株分离方法见附录B。分离目标菌株的数量应大于10株，当低于10株时，应补充采集样品数量。 药物敏感性试验见附录C。 7评价对象 7.1不同养殖阶段的同批次动物 针对不同的养殖阶段的同批次动物及时进行采样、细菌分离和药敏试验，评价细菌耐药性水平变化。 7.2同一养殖场不同圈舍的动物 在相同时间，针对同一养殖场不同圈舍的动物进行采样、细菌分离及药敏试验。 7.3不同养殖方式的动物 评价不同养殖方式下的畜禽动物细菌耐药性水平差异，采样时间和方案应完全一致。分离菌株数量 和种类应保持一致。 7.4监测时期的动物 在进行大规模耐药性监测时，应在规定时间完成耐药性水平评价。 8评价方法 8.1单抗菌药物耐药性评价 比较养殖场分离菌株对单一抗菌药耐药率的高低。 全国团体标准信息平台 T/ZNZ163—2023 48.2多抗菌药物耐药性评价 比较养殖场分离菌株对多个具体抗菌药耐药率的高低。 8.3整体耐药水平评价 8.3.1耐药强度系数 统计养殖场分离的大肠埃希菌或肠球菌的MIC值，若MIC值超出药敏板测定范围，则以最大测定值 的下一个二倍梯度作为MIC修正值。将全部MIC值（含修正值）取10的对数，求得平均值和中位值作 为耐药强度系数值。若耐药强度系数低（高）于对照组或区域水平，则认为耐药水平低（高）。 8.3.2多重耐药率 计算养殖场3重、5重和7重耐药率。若多重耐药率低（高）于对照组或区域水平，则认为整体耐药 水平低（高）。 9记录 记录时必须按照管理程序进行。应保留原始的细菌分离鉴定以及药敏结果，记录表见附录D，并保 留记录6年以上。 10生物安全 10.1实验室应符合GB4789.1和GB19489的要求。 10.2废弃物处理应按照GB19489规定执行。 10.3菌株管理按照中华人民共和国农业农村部令第16号文件中动物病原微生物菌(毒)种保藏管理相 关规定执行。 全国团体标准信息平台 T/ZNZ163—2023 5附录A （资料性） 采样记录表 采样记录表见表A.1。 表A,1采样记录表 被采样单位单位名称 通讯地址 定位 联系人 电话 传真 采样单位单位名称 联系人 通讯地址 邮编 联系电话 传真 E-mail 被采样单位签字： 采样日期：年月日采样人签字： 采样日期：年月日 样品来源 样品类型 数量（份） 采样基数 样品编号 □猪 日龄____ □鸡 日龄____ □鸭 日龄____ 其他_______日龄____□粪便 □肛拭子 拟分离细菌 样品编号规则 □大肠埃希菌 □肠球菌 其他__________________采样编号按照“动物-采样地-采样年月-样品类型-菌株编号”的格式 进行。如C-ZH-202002-F-01，其中：C（鸡）Z（浙）H（杭州）2020 （年）02（月）F（粪便）01（序号） 采样城市以省份+城市拼音首字母表示。 建议样品类型为：粪便（F），肛拭子（S），其他（Q） 建议动物简写为：鸡（C）、鸭（D）、猪（P） 养殖场信息单位名称 通讯地址 GPS定位 联系人 电话 传真 养殖量 养殖用药情况 全国团体标准信息平台 T/ZNZ163—2023 6附录B （规范性） 菌株分离与鉴定方法 B.1大肠埃希菌分离鉴定程序 B.1.1将采集的样品挑取在BPW培养基中，在36℃±1℃条件下培养12h，进行预增菌； B.1.2用接种环蘸取少量培养液，在伊红美蓝琼脂平板或麦康凯琼脂平板上四区划线，36℃±1℃培 养12h～24h； B.1.3在伊红美蓝平板上挑取金属绿色，麦康凯培养基上挑取粉红色、边缘光滑的可疑菌落，并在在伊 红美蓝琼脂平板上纯化一代； B.1.4纯化后可疑菌落接种在LB琼脂平板，继续纯化一代，在36℃±1℃条件下培养12h，挑取单 菌落进行下一步鉴定。 B.1.5对于已纯化的菌落，可使用微生物生化鉴定系统或者微生物质谱仪进行鉴定。使用生化鉴定试剂 盒或鉴定卡的判别按GB4789.38执行。 B.2肠球菌分离鉴定程序 B.2.1将采集的样品挑取在BPW培养基中，在36℃±1℃条件下培养12h，进行预增菌； B.