ICS67.060 CCSB23T/ZNZ 浙江省农产品质量安全学会团体标准 T/ZNZ164—2023 谷物及其制品中链格孢霉毒素测定液相色 谱-串联质谱法 DeterminationofAlternariatoxinsincerealanditsproducts Liquidchromatography-tandemmassspectrometry 2023-01-18发布 2023-01-18实施 浙江省农产品质量安全学会发布 全国团体标准信息平台 T/ZNZ164—2023 I前  言 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起 草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由浙江省农产品质量安全学会提出并归口。 本文件起草单位：浙江省农业科学院农产品质量安全与营养研究所、扬州方广食品有限公司、温州 科技职业学院、建德市农业农村局。 本文件主要起草人：吉小凤、杨华、王小骊、杨伟康、廖琳慧、肖英平、余红伟、吕文涛、汪雯、 唐标、汪建妹、李锐、邓涛、贺烨宇。 全国团体标准信息平台 T/ZNZ164—2023 1谷物及其制品中链格孢霉毒素测定液相色谱-串联质谱法 1范围 本文件规定了谷物及其制品中交链孢酚单甲醚（Alternariolmonomethylether，AME）、交链孢酚 （Alternariol，AOH）、滕毒素（Tentoxin，TEN）、交链孢菌酮酸（Tenuazonicacid，TeA）的液相色 谱-串联质谱测定方法。 本文件适用于小麦、大米、面条、饼干等食品中链格孢霉毒素的测定。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4原理 试样中的交链孢酚单甲醚、交链孢酚、滕毒素、交链孢菌酮酸用乙腈-水-甲酸混合液提取，经分散 固相萃取，液相色谱-串联质谱法测定，外标法定量。 5试剂和材料 除另有说明，所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682规定的一级水。 5.1试剂 5.1.1乙腈（CH3CN）：色谱纯。 5.1.2甲醇（CH3OH）：色谱纯。 5.1.3甲酸（HCOOH）：色谱纯。 5.1.4乙酸铵（CH3COONH4）：色谱纯。 5.2试剂配制 5.2.1乙腈-水-甲酸溶液（79+20+1，V/V）：取79mL乙腈（5.1.1）、20mL水、1mL甲酸（5.1.3）， 混匀。 5.2.2甲醇-水溶液（50+50，V/V）：取50mL甲醇（5.1.2）、50mL水，混匀。 全国团体标准信息平台 T/ZNZ164—2023 25.2.3乙酸铵水溶液（5mmol/L）：取0.3854g乙酸铵（5.1.4）溶解于烧杯中，再转移到1000mL容 量瓶中，用水定容至刻度。 5.3标准品 交链孢酚单甲醚（Alternariolmonomethylether，C15H12O5，CAS号：26894-49-5）、交链孢酚 （Alternariol，C14H10O5，CAS号：641-38-3）、滕毒素（Tentoxin，C22H30N4O4，CAS号：28540-82-1）、 交链孢菌酮酸（Tenuazonicacid，C10H15NO3，CAS号：610-88-8）。纯度≥98%，或经国家认证并授予 标准物质证书的标准物质。 5.4标准溶液配制 5.4.1标准储备液（100mg/L）：分别准确称取各适量（精确至0.01mg）的链格孢霉毒素（交链孢酚 单甲醚、交链孢酚、滕毒素、交链孢菌酮酸）标准品，用乙腈配制成100mg/L的标准储备液，于-18℃ 避光保存。 5.4.2标准中间液（1.0mg/L）：分别吸取适量链格孢霉毒素（交链孢酚单甲醚、交链孢酚、滕毒素、 交链孢菌酮酸）标准品标准储备液（100mg/L），用甲醇-水溶液（5.2.2）稀释成链格孢霉毒素（交链 孢酚单甲醚、交链孢酚、滕毒素、交链孢菌酮酸）浓度均为1.0mg/L的混合标准工作液，于-18℃避光 保存。 5.5材料 5.5.1十八烷基硅烷键合硅胶（C18）：粒径40μm～60μm。 5.5.2微孔滤膜（有机相）：0.22μm，或相当者。 6仪器和设备 6.1液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源（ESI）。 6.2分析天平：感量0.01g和0.01mg。 6.3氮气浓缩仪。 6.4粉粹机。 6.5离心机：转速≥10000r/min。 6.6涡旋振荡器。 6.7超声波清洗器。 6.8筛网：0.5mm～2mm孔径。 7分析步骤 7.1试样制备与保存 采样量需大于1kg，用高速粉粹机将其粉粹，过筛，使其粒径小于2mm孔径试验筛，混合均匀后 缩分制100g，储存于样品瓶中，试样于4℃以下密封保存，供检测用。 7.2提取和净化 称取5g试样（精确至0.01g）于50mL离心管中，准确加入20mL乙腈-水-甲酸溶液（5.2.1），超声 30min，震荡5min，静置20~30min，震荡5min。8500r/min离心5min，移取6mL上清液转入至内含200 全国团体标准信息平台 T/ZNZ164—2023 3mgC18（5.5.1）的塑离心管中，涡旋混合30s，8500r/min离心5min，移取上清液4.0mL于10mL玻璃 管中，于40oC下用氮气吹干。加入1.0mL甲醇-水溶液（5.2.2）溶解残留物，涡旋混匀10s，残渣溶液转 移到1.5mL离心管，于12000r/min离心3min，吸取上清液过微孔滤膜（5.5.2），待测定。 警示：整个分析操作过程应在指定区域内进行。该区域应避光（直射阳光）、具备相对独立的操 作台和废弃物存放装置。在整个实验过程中，操作者应按照接触剧毒物的要求采取相应的保护措施。 7.3测定条件 7.3.1液相色谱条件 色谱条件如下： a）色谱柱：C18色谱柱，2.1mm（内径）×100mm，1.7µm，或性能相当者。 c）柱温：40℃。 d）流速：0.2mL/min。 e）进样量：5µL。 f）流动相：A相为5mmol/L乙酸铵水溶液（5.2.3），B相为甲醇（5.1.2）。流动相梯度条件见表 1。 表1流动相及其梯度条件 时间（min） 流动相A（%） 流动相B（%） 0.00 95 5 1.00 95 5 4.00 5 95 8.00 5 95 8.10 95 5 10.00 95 5 7.3.2质谱参考条件 质谱参考条件： a）离子化方式：电喷雾离子源（ESI）。 b）扫描方式：负离子扫描。 c）气帘气：35psi d）电喷雾电压：-4500V; e）离子源温度：500℃。 f）喷雾气：50psi。 g）辅助加热气：55psi。 h）多反应监测（MRM）：每种毒素分别选择至少两个子离子，质谱参数见附录A。 7.4基质匹配标准工作溶液配制 选择与被测样品性质相同或相似的空白样品按照7.2部分进行前处理，得到空白基质提取液。精准 吸取一定量的混合标准溶液，逐级用空白基质溶液稀释成质量浓度为1μg/L、5μg/L、10μg/L、20μg/L、 50μg/L、100μg/L和200μg/L的系列标准工作溶液，或根据仪器响应与实际情况配制适当浓度范围的标 全国团体标准信息平台 T/ZNZ164—2023 4准曲线。经液相色谱-串联质谱仪分析后，以链格孢霉毒素定量用子离子的质量色谱图峰面积为纵坐标， 相对应的基质匹配标准工作溶液质量浓度为横坐标，绘制基质匹配标准工作曲线。 7.5定性及定量 7.5.1定性 被测试样中目标化合物色谱峰的保留时间与相应标准色谱峰的保留时间相比较，相对误差应在 ±2.5%之内。在相同实验条件下进行样品测定时，如果检出的色谱峰的保留时间与标准样品相一致，并 且在扣除背景的样品质谱图中，目标化合物选择的子离子均出现，而且同一检测批次，对同一化合物， 样品中目标化合物的离子丰度比与质量浓度相当的基质标准溶液相比，其允许偏差不超过表2规定的范 围，则可判断样品中存在目标化合物。 表2定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 相对离子丰度（%） ＞50 ＞20-50 ＞10-20 ≤10 允许的相对偏差（%） ±20 ±25 ±30 ±50 本方法的标准物质LC-MS/MS多反应监测（MRM）质量色谱图参见附录B。 7.5.2定量 取试样溶液、基质匹配标准溶液，作单点或多点校准，按外标法以定量用子离子的质量色谱图峰面 积定量，待测样液中目标化合物的响应值应在仪器检测的定量测定线性范围之内，超过线性范围时应根 据测定浓度进行适当倍数稀释再进行分析。 7.6平行试验 按以上步骤对同一试样进行平行试验测定。 7.7空白试验 除不加试样外，采用完全相同的测定步骤进行测定。 7.8结果计算 试样中链格孢霉毒素以质量分数ω计，单位为微克每千克（μg/kg），按式（1）计算的含量: 式中: ω———试样中被测物含量，单位为微克每千克（μg/kg）; A———试样溶液中被测物的质量色谱图峰面积； As———基质匹配标准工作液中被测物的质量色谱图峰面积； ρs———基质匹配标准工作溶液中被测物的质量浓度，单位为微克每升（μg/L）; V———试样溶液最终定容体积，单位为毫升（mL）； m———样品称样量，单位为克（g）； f1———净化液与总提取液体积比； f2———稀释倍数 全国团体标准信息平台 T/ZNZ164