ICS 01.120 A 00 DB34 安 徽 省 地 方 标 准 DB 34/T 3489—2019 猪瘟病毒抗体快速检测方法 疫层析法 镧系荧光免 The Rapid Detection Methods for Antibodies to Classical Swine Fever Virus Lanthanide Fluorescence Immunochromatographic Assay 文稿版次选择 2019 - 12 - 25 发布 安徽省市场监督管理局 2020 - 01 - 25 实施 发 布 DB34/T 3489—2019 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准由安徽农业大学提出并起草。 本标准由安徽省农业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：安徽农业大学、安徽浩翔农牧有限公司、安徽冠华农牧有限公司、安徽禾丰浩翔 农业发展有限公司、安徽省动物疫病预防与控制中心、阜阳市动物卫生监督所、怀宁县动物疫病预防与 控制中心、巢湖市畜牧兽医局、六安市动物疫病预防与控制中心、成都微瑞生物科技有限公司。 本标准主要起草人：李郁、何长生、占松鹤、谢玉洁、程竹兵、李春芬、程圣芳、高亚飞、段倩倩、 孙裴、袁献宇、高亚成、蒋广志、张和森。 I DB34/T 3489—2019 猪瘟病毒抗体快速检测方法 镧系荧光免疫层析法 1 范围 本标准规定了猪瘟病毒抗体快速检测方法 镧系荧光免疫层析法的原理、仪器和试剂、样品采集与 处理、操作方法、结果计算、生物安全和防污染措施。 本标准适用于猪瘟病毒抗体的快速检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 27401 实验室质量控制规范 动物检疫 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3 原理 镧系荧光免疫层析法（lanthanide fluorescence immunochromatographic assay， LFIA）快速检 3+ 测猪瘟病毒抗体，系采用镧系元素铕（Eu ）荧光纳米微球作荧光示踪物，分别标记猪瘟病毒重组 E2 蛋 白抗原和鸡 IgY，并埋置在标记垫内。硝酸纤维素膜上检测线（T）包被猪瘟病毒重组 E2 蛋白抗原、 3+ 参考线（C）包被山羊抗鸡 IgY 抗体。当血清样品抗体与镧系元素铕（Eu ）荧光纳米微球标记的猪瘟 病毒重组 E2 蛋白抗原接触反应后形成免疫复合物，继续与硝酸纤维素膜上检测线（T线）包被的猪瘟 病毒重组 E2 蛋白抗原反应形成复合物；其余物质向前层析，在 C 线处包被的山羊抗鸡IgY抗体与镧系 3+ 元素铕（Eu ）荧光纳米微球标记的鸡 IgY 结合形成免疫结合物。最后用镧系荧光分析仪读取检测卡上 的荧光信号，经计算即可得出猪瘟病毒抗体效价。 4 仪器与试剂 4.1 4.1.1 4.1.2 4.1.3 4.1.4 4.1.5 4.2 4.2.1 仪器 镧系荧光分析仪：激发波长为(400±20)nm，检测波长为(615±10)nm。 单道可调微量移液器：0.5 μL～10 μL，20 μL～200 μL，100 μL～1000 μL。 分析天平：精度 0.001 g。 离心机：转速 5000～15000 r/min。 冰箱：2℃～8℃，-20℃。 试剂 实验用水：应符合 GB/T 6682 中一级水的规格。 1 DB34/T 3489—2019 4.2.2 样品稀释液 4.2.2.1 成分：硼酸 2.16 g，硼砂 1.43 g，叠氮化钠 0.25 g，硫酸葡聚糖 1.00 g ，蒸馏水 1000 mL。 4.2.2.2 制法：将上述成分溶解混匀后分装，保存于 4℃备用。 4.2.2.3 所用试剂均为分析纯。 4.2.3 猪瘟病毒抗体镧系荧光免疫层析法检测试剂卡：见附录 A。 5 样品采集与处理 5.1 样品的采集 按照 NY/T 541 的规定，采集待检猪血液样品 3 mL～5 mL。 5.2 样品的处理 血液样品用离心机 3000 r/min、离心 3 min，血清量不少于 500 μL。 5.3 样品的贮存 血清样品在 2℃～8℃冷藏可保存 24 h，如需长期保存应置 -20℃以下。 6 操作方法 6.1 准备 使用前，将待检血清样品和猪瘟病毒抗体镧系荧光免疫层析法检测试剂卡平衡至 23℃～25℃。 6.2 稀释 用样品稀释液将待检血清样品按 1:50 稀释。 6.3 加样 将猪瘟病毒抗体镧系荧光免疫层析法检测试剂卡水平放置，用移液器吸取已稀释好的待检血清样品 80μL 垂直滴加于加样孔内。 6.4 检测 避光层析 15 min 后用镧系荧光分析仪进行检测。 7 结果计算 B ——镧系荧光分析仪读取标准溶液或样品溶液的检测卡上的荧光信号 T/C 值 BO ——镧系荧光分析仪读取稀释液检测卡上的荧光信号的 T/C 值 以标准品 B-BO 值的对数为横坐标，以猪瘟病毒抗体阳性血清效价对数为纵坐标，绘制标准曲线图。 将样品的荧光信号值带入标准曲线中，从标准曲线上读出样品所对应的猪瘟病毒抗体效价。 标准曲线示意图参见附录B 图B.1。 8 生物安全及防污染措施 2 DB34/T 3489—2019 8.1 生物安全措施 按照 GB 19489 中的有关规定执行。 8.2 防污染措施 防污染措施应符合 GB/T 27401 的规定。 3 DB34/T 3489—2019 AA 附 录 A （规范性附录） 猪瘟病毒抗体镧系荧光免疫层析法检测试剂卡制备 A.1 试剂条制备 检测线（T）包被猪瘟病毒重组 E2 蛋白抗原。 质控线（C）包被山羊抗鸡 IgY 抗体（IgG）。 用划膜机将配制的检测线工作液和质控线工作液划至硝酸纤维素（NC）膜上。 3+ 采用镧系元素铕（Eu ）荧光纳米微球作荧光示踪物标记猪瘟病毒重组 E2 蛋白抗原和鸡 IgY。 用喷膜机分别将两种标记荧光纳米微球的工作液喷至玻璃纤维素膜上（标记垫）。 A.2 试剂条组装 在聚氯乙烯（PVC）底板上从左到右依次粘贴样品垫、标记垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，样品垫的 右端搭在标记垫的左端上，标记垫的右端搭在硝酸纤维素膜的左端上，吸水纸的左端搭在硝酸纤维素膜 的右端上。 将组装好的 PVC 板切成 5 mm 宽试纸条。 A.3 试剂卡装配 将切割成 5 mm 宽的试纸条放于检测卡的下盖内，摆平后将检测卡的上盖扣紧。即完成猪瘟病毒抗 体镧系荧光免疫层析法检测试剂卡（简称试剂卡），见图A.1。 图A.1 4 猪瘟病毒抗体镧系荧光免疫层析法检测试剂卡装配示意图 DB34/T 3489—2019 BB 附 录 B （资料性附录） 猪瘟病毒抗体镧系荧光免疫层析法标准曲线 图中： x：样品检测线的荧光值与对照线的荧光值之比（T/C）的对数。 y：样品抗体效价的对数。 2 R ：相关系数。 图B.1 猪瘟病毒抗体镧系荧光免疫层析法标准曲线示意图 _________________________________ 5