ICS 11.220 B 41 DB34 安 徽 省 地 方 标 准 DB 34/T 3642—2020 鸡滑液囊支原体 LAMP 快速检测技术规程 Technical Regulations of LAMP Assay for Rapid Detection of Mycoplasma Synoviae 文稿版次选择 2020 - 06 - 22 发布 安徽省市场监督管理局 2020 - 07 - 22 实施 发 布 DB34/T 3642—2020 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准由阜阳市畜牧兽医局提出。 本标准由安徽省农业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：阜阳市立华畜禽有限公司、阜阳市动物疫病预防与控制中心、颍东区动物疫病预 防与控制中心、安徽省动物疫病预防与控制中心、萧县畜牧兽医水产服务中心。 本标准主要起草人：张海涛、孟宪臣、洪功飞、李维民、王晓晖、靳宇田、郑玉才、罗燕、薛亚梅、 丁平云、张明飞、梁静、刘新、马群山、牛洪波、张娟娟。 I DB34/T 3642—2020 鸡滑液囊支原体 LAMP 快速检测技术规程 1 范围 本标准规定了鸡滑液囊支原体LAMP检测主要仪器、主要试剂、引物、样品的采集和处理、检测步骤。 本标准适用于鸡滑液囊支原体LAMP的实验室检测、临床快速可视化检测和筛查。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 MS（Mycoplasma Synoviae）：鸡滑液囊支原体 LAMP（Loop-mediated Isothermal Amplification Assay）：环介导等温扩增 4 主要仪器 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 4.6 4.7 4.8 4.9 4.10 5 5.1 高速台式冷冻离心机（最大转速 15000 rpm） 生物安全通风橱 微量移液器（10 μL、100 μL、1000 μL） -80℃超低温冰箱 高压蒸汽灭菌锅 电热恒温水槽（室温～100℃） 微量振荡器 电泳仪 电热恒温鼓风干燥箱 pH 计 主要试剂 1 mol/L 三羟甲基氨基甲烷-盐酸（pH 8.0） 三羟甲基氨基甲烷 12.11 g，灭菌双蒸水 80 mL，浓盐酸调 pH 至 8.0，灭菌双蒸水加至 100 mL。 5.2 0.5 mol/L 乙二铵四乙酸二钠（EDTA）溶液（pH 8.0） 1 DB34/T 3642—2020 二水乙二铵四乙酸二钠 18.61 g，灭菌双蒸水 80 mL，氢氧化钠调 pH 至 8.0，灭菌双蒸水加至 100 mL。 5.3 20％十二烷基硫酸钠（SDS）溶液（pH 7.2） 十二烷基硫酸钠 20 g，灭菌双蒸水 80 mL，浓盐酸调 pH 至 7.2，灭菌双蒸水加至 100 mL。 5.4 消化液 1 mol/L 三羟甲基氨基甲烷-盐酸（pH 8.0）2 mL，0.5 mol/L 乙二铵四乙酸二钠（EDTA）溶液（pH 8.0）0.4 mL，20％十二烷基硫酸钠（SDS）溶液（pH 7.2）5 mL，5 mol/L 氯化钠 4 mL，灭菌双蒸水 加至 200 mL。 5.5 2％蛋白酶 K 溶液 蛋白酶K（分析纯）5 g，灭菌双蒸水加至 250 mL。 5.6 酚-三氯甲烷-异戊醇混合液 碱性酚 25 mL，三氯甲烷 24 mL，异戊醇 1 mL。 5.7 PBS（磷酸盐缓冲液） 5.8 双蒸水（符合 GB/T 6682 的要求） 5.9 Bst DNA Polymerase 试剂盒 5.10 DL2000 DNA Marker 5.11 6×Loading Buffer 6 引物 按 照 GenBank 上 公 布 的 鸡 滑 液 囊 支 原 体 （ MS ） EF-TU 基 因 序 列 （ 登 录 号 CP011096 ） ， 应 用 PrimerExplorer V4设计引物，引物序列如下： ——F3：5'- CACAAATGGATGGTGCTATTCTT -3' ——B3：5'-TACTGCGTCACCTTCAAGTGCT-3' ——FLP：5'-CGTGAACACATTCTTCTTTCAAAAC-3' ——BLP：5'- ATCCGTATTCTGATAATAGATCACG-3' ——FIP：5'- TTGTTTAGGAAAACCACCATTCTTGGTGCAACAGATGGGCCTATG-3' ——BIP：5'- ACGAAGAAATGATTGGGCTTGTTGCCTCTAACGATAGGAGCGTTGTC-3' 双蒸水溶解后分装，-20℃冰箱保存备用。 7 样品的采集和处理 7.1 样品采集和储运 无菌采集咽喉拭子，关节囊肿和胸部囊肿的内部炎性分泌物，放入盛有 1.0 mL PBS 溶液（高压冷 却后的 PBS 溶液，无菌条件下加入青霉素 1000 IU/mL）的 1.5 mL 离心管中，加盖标记。 样品采集后，放入密闭的塑封袋内（一个采样点的样品，放在一个塑封袋内），标记后封存于加有 冰袋的保温箱内，24 h 内进行样品处理。 7.2 2 样品处理 DB34/T 3642—2020 样品在震荡器上充分混合后，反复冻融 3 次，将全部溶液转入无菌的 1.5 mL 离心管，编号备用。 7.3 处理后的样品存放 制备的样品在 2℃～8℃条件下保存应不超过 24 h，如需长期保存应置 -70℃以下，应避免反复冻 融。 8 检测步骤 8.1 核酸提取 8.1.1 取 n 个灭菌的 1.5 mL 离心管，其中 n 为被检样品、阳性对照和阴性对照数量之和，编号。其中 阳性对照样品为 PCR 鉴定为 MS 的病料或阳性病料接种培养基后获得的 MS 纯培养物，阴性对照样品为灭 菌双蒸水。 8.1.2 每管加入待检样品（已研磨好的被检样品上清，阳性对照样品和阴性对照样品）100 μL，加入 500 μL 消化液和 10 μL 2％蛋白酶 K 溶液，混匀，置 55℃水浴中 30 min。 8.1.3 每管加入 600 μL 酚-三氯甲烷-异戊醇混合液，用力颠倒 10 次混匀，12000 rpm 离心 10 min。 8.1.4 取上清 500 μL 置 1.5 mL 灭菌离心管中，加入等体积异丙醇，混匀，置 -80℃冰箱中 30 min， 取出离心管，室温融化，4℃，12000 rpm 离心 15 min。 8.1.5 弃上清，沿离心管开口方向管壁缓缓滴入 1 mL -20℃预冷的 75％乙醇溶液，轻轻旋转洗一次 后倒掉，将离心管倒扣于吸水纸上 1 min，置 37℃干燥箱干燥 30 min。 8.1.6 取出离心管，用 50 μL 灭菌双蒸水溶解沉淀，作为模板备用。若需长期保存须放置在 -80℃冰 箱。 8.2 8.2.1 扩增 扩增试剂准备 从 Bst DNA Polymerase 试剂盒中取出相应的试剂，同时取出 MS LAMP 引物和双蒸水。 设所需 PCR的检测总数为 n，其中 n 为被检样品、阳性对照与阴性对照之和，每个样本测试反应 体系配制见表1。 表1 试剂 8.2.2 每个样本测试反应体系配置表 用量 /μL 终浓度 10×ThermoPol buffer 2.5 1×（含 2 mM MgSO4） MgSO4（100 mM） 1.5 6 mM（总量 8 mM） dNTP Mixture（10 mM） 3.5 1.4 mM/每种 FIP/BIP引物 1 1.6 μM F3/B3引物 1 0.2 μM FLP/BLP引物 1 0.4 μM Bst DNA聚合酶 1 320 U/mL DNA模板 2 >10 个拷贝数或更多 灭菌双蒸水 补至 25 加样 3 DB34/T 3642—2020 在各设定的 PCR 管中分别加入 8.1.6 中制备的 DNA 溶液各 2 μL，瞬时离心 3～5 s。 8.2.3 LAMP 反应 将 8.2.2 中离心后的 PCR 管编号，放入 65℃水浴锅内 30～60 min，之后置 80℃温育 20 min 失活。 8.2.4 结果观察 8.2.4.1 每个样本取 9 μL 的 LAMP 产物，加入 1 μL 的 10×Loading buffer，混匀后，吸取 10 μL 样品加入配制好的琼脂糖凝胶中，同时加入 DL2000 DNA Marker，之后在电压 100 V 下，经 15～30 min 电泳，将凝胶放入凝胶成像系统中进行观察，并拍照记录（参见附录 A）。 8.2.4.2 阳性对照反应管有梯状目的条带，阴性对照无条带，实验成立。 8.2.4.3 检测样品出现与阳性对照相同梯状条带的判断为阳性，即该样品的 MS 核酸呈阳性，反之则 为阴性。 4 DB34/T 3642—2020 AA 附 录 A （资料性附录） MS 的 LAMP 产物琼脂凝胶电泳检测 MS 的 LAMP 产物琼脂凝胶电泳检测见图A.1。 图中： M：DL2000 Marker； 1：阳性对照样品； 2：鸡新城疫、传染性支气管炎病毒核酸 cDNA； 3：鸡马立克病毒核酸； 4：鸡痘病毒核酸； 5：血清4型禽腺病毒核酸； 6：检测样品。 表A.1 MS 的 LAMP 产物琼脂凝胶电泳图 _________________________________ 5