ICS 11.020 C 62 DB32 江 苏 省 地 方 标 准 DB 32/T 3762.5—2020 新型冠状病毒检测技术规范 第 5 部分：血清 IgM 和 IgG 抗体酶联免疫 吸附检测程序 Technical specifications for SARS-CoV-2 detection Part 5: Serum IgM and IgG antibodies test procedure by ELISA 2020 - 03 - 02 发布 江苏省市场监督管理局 2020 - 03 - 03 实施 发 布 DB32/T 3762.5—2020 目 前 次 言 ............................................................................ II 1 范围 .............................................................................. 1 2 规范性引用文件 .................................................................... 1 3 术语和定义 ........................................................................ 1 4 环境与设施 ........................................................................ 1 5 设备与耗材 ........................................................................ 1 6 试剂与材料 ........................................................................ 1 7 样本采集 .......................................................................... 2 8 样本运输 .......................................................................... 2 9 酶联免疫吸附检测步骤 .............................................................. 2 I DB32/T 3762.5—2020 前 言 DB32/T 3762《新型冠状病毒检测技术规范》目前分为以下部分： ——第1部分：生物样本采集、运输和保存； ——第2部分：病毒分离与鉴定； ——第3部分：核酸荧光PCR检测程序； ——第4部分：重组酶介导等温扩增程序； ——第5部分：血清IgM和IgG抗体酶联免疫吸附检测程序； ——第6部分：血清IgM和IgG抗体胶体金免疫层析检测程序； ——第7部分：空气样本检测与评估； ——第8部分：物体表面检测与评估； ——第9部分：医务人员职业暴露检测与评估。 本部分为DB32/T 3762 的第5部分。 本部分按照GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本部分由江苏省卫生健康委员会提出。 本部分由江苏省卫生标准化技术委员会归口。 本部分主要起草单位：江苏省疾病预防控制中心、南京医科大学、苏州第五人民医院、苏州大学附 二院、昆山市疾病预防控制中心。 本部分主要起草人：曾晓燕、朱宝立、焦永军、郭喜玲、迟莹、吴斌、程军平、徐佳南、钱志远、 罗晓明、沈欢喜。 II DB32/T 3762.5—2020 新型冠状病毒检测技术规范 第 5 部分：血清 IgM 和 IgG 抗体酶联免疫吸附检测程序 1 范围 本部分规定了新型冠状病毒者血清中 IgM 和 IgG 抗体酶联免疫吸附检测的环境与设施、设备与耗 材、试剂与材料、血清样本采集、酶联免疫吸附实验操作。 本部分适用于新型冠状病毒感染确诊病例、疑似病例以及确诊病例的密切接触者血清学检查。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 Doc9284-AN/905 危险品航空安全运输技术细则 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 3.1 IgM 和 IgG 抗体 IgM and IgG antibodies SARS-CoV-2感染人体后，除了对靶器官产生致病过程外，病毒基因组编码的结构蛋白、非结构蛋 白还刺激机体免疫系统，产生特异性免疫应答，分泌病原体特异性IgM和IgG抗体至血液循环中。 4 环境与设施 在BSL-2级实验室内进行实验。 5 设备与耗材 5.1 设备：生物安全柜、洗板机、酶标仪（含有 450nm 波长滤光片）、高压锅、生物安全运输箱、水 浴锅。 5.2 耗材：个人防护装备：N95 及以上防护口罩、护目镜、一次性防护面罩、医用无纺布帽、连体防 护服、一次性手术衣、乳胶手套、 防水靴套、真空釆血管、无菌螺旋口塑料管。 6 试剂与材料 新型冠状病毒人IgM抗体ELISA检测试剂盒、新型冠状病毒人IgG抗体ELISA检测试剂盒。 7 样本采集 1 DB32/T 3762.5—2020 用真空负压采血管采集血液样本5mL，室温静置30分钟，1500rpm～2000rpm离心10分钟，收集血 清于无菌螺口塑料管中。 8 样本运输 同本标准 第1部分6.1和6.2。 9 酶联免疫吸附检测步骤 9.1 酶联免疫吸附实验-IgM (间接法) 9.1.1 根据样本数量取出一定量的预包被抗原的酶标板并平衡至室温，每次实验设阴、阳和空白复孔 对照； 9.1.2 向板中加入 100μL/管样本稀释液，然后向其中加入 1μL 的待测血清（根据需要添加阳性、阴性 参考对照），将酶标板用封板膜封闭，置 37℃孵箱中孵育 30 分钟； 9.1.3 取出酶标板置于洗板机上用洗液洗涤（或者用洗瓶手工洗涤）5 次后，甩干孔内残留液或倒扣 酶标反应板在吸水纸上拍去孔内残留液； 9.1.4 于各孔中加入 HRP 标记的抗人 IgM 工作液 100μL/孔，置 37℃孵箱中孵育 30 分钟； 9.1.5 重复 8.1.3 步骤； 9.1.6 将显色液 A、B 液按 1:1 混合后取混合显色液每孔加 100μL，轻拍酶标反应板，混匀后置室温 5 分钟； 9.1.7 于各孔中加入终止液 50μL/孔，轻拍混匀； 9.1.8 将酶标板置于酶标仪 450nm 波长下，测定各孔光吸收 OD 值； 9.1.9 根据检测试剂设计者的要求判断结果。 9.2 酶联免疫吸附实验-IgG (间接法) 9.2.1 根据样本数量取出一定量的预包被抗原的酶标板并平衡至室温，每次实验设阴、阳和空白复孔 对照； 9.2.2 向板中加入 100μL/管样本稀释液，然后向其中加入 1μL 的待测血清（根据需要添加阳性、阴性 参考对照），亦可把血清在 1:100 稀释的基础上再进行倍比稀释。将酶标板用封板膜封闭，置 37℃孵箱 中孵育 30 分钟； 9.2.3 取出酶标板置于洗板机上用洗液洗涤（或者用洗瓶手工洗涤）5 次后，甩干孔内残留液或倒扣 酶标反应板在吸水纸上拍去孔内残留液； 9.2.4 于各孔中加入 HRP 标记的抗人 IgG 工作液 100μL/孔，置 37℃孵箱中孵育 30 分钟； 9.2.5 重复 8.2.3 步骤； 9.2.6 将显色液 A、B 液按 1:1 混合后取混合显色液每孔加 100μL，轻拍酶标反应板，混匀后置室温 5 分钟； 9.2.7 于各孔中加入终止液 50μL/孔，轻拍混匀； 9.2.8 将酶标板置于酶标仪 450nm 波长下，测定各孔光吸收 OD 值; 9.2.9 根据检测试剂设计者的要求判断结果。 _________________________________ 2