ICS 65.120 B 46 DB34 安 徽 省 地 方 标 准 DB 34/T 3476—2019 饲料中恩拉霉素的测定 高效液相色谱法 Determination of enramycin in feeds High performance liquid chromatography enramycin method 文稿版次选择 2019 - 12 - 25 发布 安徽省市场监督管理局 2020 - 01 - 25 实施 发 布 DB34/T 3476—2019 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准由安徽省兽药饲料监察所提出。 本标准由安徽省农业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：合肥中龙神力动物药业有限公司、安徽省兽药饲料监察所、安徽省动物疫病预防 与控制中心、肥西县动物疫病预防控制中心、宣州区畜牧兽医局、安徽省畜牧技术推广总站、宿州市动 物卫生监督所、中国科学技术大学附属第一医院、合肥市动物疫病预防控制中心。 本标准起草人：蔡一杰、陈静、董先敏、刘文文、李瑞、杨清、黄莺、王群、许晓靖、孟庆娟、吴 蕾、王雨霜、沈岚。 I DB34/T 3476—2019 饲料中恩拉霉素的测定 高效液相色谱法 1 范围 本标准规定了饲料中恩拉霉素含量测定的高效液相色谱法。 本标准适用于配合饲料、浓缩饲料和预混合饲料中恩拉霉素含量测定。 本标准定量限为 1.0 mg/kg。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 14699.1 饲料采样 3 原理 试样中的恩拉霉素经丙酮盐酸溶液超声提取，过滤后经色谱柱分离，用高效液相紫外检测器检测， 外标法定量。 4 试剂和材料 4.1 除特殊说明外，本方法所用试剂均为分析纯，用水符合 GB/T 6682 中一级用水的规定。 4.2 乙腈：色谱纯。 4.3 磷酸二氢钠。 4.4 丙酮。 4.5 盐酸。 4.6 流动相：0.05 mol/L 磷酸二氢钠+乙腈，按体积比 70:30（v/v）。 4.7 稀释液：丙酮-2 mol/L 盐酸-水(20:1:21)(v/v)。 4.8 恩拉霉素标准品：CAS 号 1115-82-5，纯度 ≥98.0％。 4.9 恩拉霉素标准溶液的制备 4.9.1 恩拉霉素标准溶液贮备液：精确称取 20 mg 恩拉霉素标准品(精确至 0.01 mg)于 100 mL 容量瓶 中，用稀释液（4.7）溶解，冷却，此溶液浓度为 200 μg/mL。此溶液现配现用。 4.9.2 恩拉霉素标准工作溶液：分别吸取贮备液（4.9.1）0.2 ml、1 mL、2 mL、5 mL、10 mL、20 mL 于 200 mL 容量瓶中，用稀释液（4.7）定容，标准工作溶液系列浓度分别为 0.4 μg/mL、1 μg/mL、2 μg/mL、 5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL。 5 仪器和设备 1 DB34/T 3476—2019 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 5.7 6 高效液相色谱仪(配紫外检测器)。 分析天平：感量 1 mg、0.01 mg。 离心机：3000 r/min。 超声波仪。 分析筛：孔径 0.42 mm。 粉碎机。 微孔滤膜：孔径 0.45 μm 尼龙滤膜。 试样的制备 按 GB/T 14699.1 规定采样，选取饲料样品 500ｇ以上，四分法缩减约 100ｇ，混合均匀，磨碎， 全部通过分析筛(5.5)，充分混匀，装入磨口瓶中备用。 7 分析步骤 7.1 提取 7.1.1 称取试样适量（配合饲料 5.0 g、浓缩饲料 3.0 g、预混合饲料 1.0 g），精确至 0.001 g，置 于 100 mL 容量瓶中，用稀释液（4.7）准确定容，置于超声波仪（5.4）超声提取 30 min。 7.1.2 将试样提取液（7.1.1）4 ml 转移至离心管，3000 r/min，离心 5 min，取上清液 2 mL 用 0.45 μm 尼龙滤膜过滤，滤液作为试样溶液上机测定。 7.2 高效液相色谱条件 7.2.1 7.2.2 7.2.3 7.2.4 7.2.5 7.2.6 7.3 色谱柱：C18 型柱，长 250 mm，内径 4.6 mm，粒径 5 μm，或相当性能 C18 柱； 检测波长：267 nm； 流动相：0.05 mol/L 磷酸二氢钠+乙腈，按体积比 70:30（v/v）； 流速：1.0 mL/min； 柱温：室温； 进样体积：10 μL。 上机测定 按上述色谱条件，分别将恩拉霉素标准工作溶液（4.9.2））和试液（7.1.2）上机测定，以单点或 多点校准，以色谱峰面积积分值定量。色谱图参见附录A。 7.4 结果的计算与表述 7.4.1 计算公式 结果按式(1)计算： ................................. (1) 式中： X ——试样中恩拉霉素含量，单位为毫克/每千克（mg/kg）； C ——试液色谱峰对应的恩拉霉素浓度，单位为微克/每毫升（μg/mL）； 2 DB34/T 3476—2019 m ——试样质量，单位为克（g）； V ——定容体积，单位为毫升（mL）； f ——稀释倍数。 7.4.2 结果表示 平行测定结果用算术平均值之和表示，计算结果保留 3 位有效数字。 8 精密度 在重复性条件下获得的 2 次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的 10％。 3 DB34/T 3476—2019 AA 附 录 A （资料性附录） 恩拉霉素标准溶液的液相色谱图 图A.1 恩拉霉素标准溶液的液相色谱图 _________________________________ 4