ICS 65.150 CCS B 52 DB51 四 川 省 地 方 标 准 DB51/T 2913—2022 大口黑鲈诺卡氏菌病诊断和防治技术规程 Specification for diagnosis and control of Pathogen Nocardiosis from Micropterus salmoides 2022 - 05 - 20 发布 四川省市场监督管理局 2022 - 07 - 01 实施 发 布 DB51/T 2913—2022 目 次 前言 ................................................................................. II 1 范围 ............................................................................... 1 2 规范性引用文件 ..................................................................... 1 3 术语和定义 ......................................................................... 1 4 试剂和材料 ......................................................................... 1 5 设备和仪器 ......................................................................... 2 6 临床检查 ........................................................................... 2 7 实验室样品采集 ..................................................................... 2 8 细菌的分离与培养 ................................................................... 2 9 细菌的鉴定 ......................................................................... 2 10 结果判定 .......................................................................... 4 11 综合判定 .......................................................................... 5 12 防治方法 .......................................................................... 5 附录 A（规范性） 培养基和试剂配制方法 ................................................. 6 附录 B（资料性） 16S rDNA 基因参考序列（GeneBank 登录号：JCM3360） ..................... 7 I DB51/T 2913—2022 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件由四川省农业农村厅提出、归口并解释。 本文件起草单位：成都农业科技职业学院、四川农业大学、内江师范学院。 本文件主要起草人：李成伟、耿毅、王均、贺扬、吴宏伟、刘海燕、王振华、李建臻、黎丽。 本文件首次发布。 II DB51/T 2913—2022 大口黑鲈诺卡氏菌病诊断和防治技术规程 1 范围 本文件规定了大口黑鲈（Micropterus salmoides）养殖过程中发生的诺卡氏菌病的流行情况、发 病症状、诺卡氏菌的分离培养、形态学鉴定、生理生化鉴定、16S rRNA基因鉴定、特异性鉴定及其防治 等技术规程。 本文件适用于大口黑鲈诺卡氏菌病的诊断和防治。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 14926.43 实验动物 细菌学检测 染色法、培养基和试剂 GB/T 27623.1 渔用抗菌药物药效试验技术规范 NY 5051 无公害食品 淡水养殖用水水质标准 SC/T 1132 渔药使用规范 SC/T 7014 水生动物检疫实验室技术规范 SC/T 7103 水生动物产地检疫采样技术规范 DB51/T 526 大口黑鲈养殖技术规范 食用鱼 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 大口黑鲈诺卡氏菌病 nocardiosis of largemouth bass 指由鰤诺卡氏菌（Nocardia seriolae）感染大口黑鲈引起的一种细菌性传染病。 4 试剂和材料 4.1 水 用水符合GB/T 6682-2008中一级水规格。 4.2 试剂与培养基 革兰氏染液配制按照GB/T 14926.43中的规定执行，牛脑心浸液培养基（BHI）、50×TAE缓冲液、 1%琼脂糖凝胶、七叶苷培养基、明胶培养基等相关配方见附录A，细菌基因组DNA提取试剂盒、PCR纯化 试剂盒选用专业试剂公司提供的商品化试剂盒。 1 DB51/T 2913—2022 4.3 16S rRNA 扩增引物 16S rRNA 基 因 序 列 扩 增 引 物 ， 27F ： 5 ′ -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ′ ， 1492R ： -GGTTACCTTGTTACGACTT -3′。 5′ 4.4 特异性鉴定引物 特 异 性 鉴 定 上 游 引 物 N5F1 ： 5 ′ -TGAGCCTGAACTGCATGGTTC-3 ′ ， 下 游 引 物 N5R1 ： 5 ′ -ACGGTATCGCAGCCCTCTGTA-3′。 5 设备和仪器 超净工作台、光学显微镜、PCR仪、电泳仪、离心机、生化培养箱、恒温摇床培养箱、常规细菌接 种器械（包括培养皿、酒精灯、接种环、酒精棉等）、4℃/-20℃冰箱等。 6 临床检查 6.1 流行情况 水温15～32℃时都可流行，我省在每年4月底开始大规模爆发，直至10月均有该病流行，25～ 28℃为发病高峰期，死亡率高。 6.2 临床和解剖症状 患病鱼反应迟钝、离群独游，食欲下降，主要病变为体表出现溃疡灶以及出血点，在鳃丝、躯干皮 下脂肪、肌肉、腹腔（包括肝、肾、脾、鱼鳔、肠系膜）出现乳白色或黄色结节，结节大小通常直径 0.5～ 3mm，肝脏肿大、淤血，鱼鳔腔内有积液等。 7 实验室样品采集 样品采集按SC/T 7013中的规定执行。 8 细菌的分离与培养 用75%酒精棉球对样品体表进行擦拭消毒后，无菌操作取肝脏、头肾、中肾和脾脏进行病原菌分离。 利用接种环，划线接种至BHI固体培养基，28℃恒温培养箱培养7～12d，从形态一致的优势菌群中挑取 单个菌落进一步纯化培养。 9 细菌的鉴定 9.1 形态学鉴定 9.1.1 菌落形态 分离病原菌在BHI固体培养基28℃培养7～12d后观察菌落形态。 9.1.2 细菌形态 2 DB51/T 2913—2022 革兰氏染色法染色观察，参照GB/T 14926.43中的规定执行。 9.2 生化特性鉴定 9.2.1 氧化酶试验 按SC/T 7014中的规定执行，菌落呈玫瑰红色，然后变为深紫色者为阳性。 9.2.2 尿素酶试验 按SC/T 7014中的规定执行，红色为阳性。 9.2.3 硝酸盐还原试验 按SC/T 7014中的规定执行，红色为阳性。 9.2.4 过氧化氢酶试验 挑取单个菌落，置于洁净的载玻片上，加入3%过氧化氢1～2滴，观察有无气泡产生，有气泡产生者 为阳性。 9.2.5 柠檬酸盐试验 按SC/T 7014中的规定执行，培养基蓝色为阳性。 9.2.6 七叶苷水解试验 将待检菌接种于七叶苷培养基，28℃培养7～12d，培养基变为黑色为阳性，不变色者为阴性。 9.2.7 明胶液化试验 将待检菌种接种于明胶培养基，28℃培养7～12d，明胶液化者为阳性。 9.2.8 淀粉水解试验 按SC/T 7014中的规定执行，呈蓝色者为阴性，无蓝色者为阳性。 9.3 16S rRNA 鉴定 9.3.1 总 DNA 提取 DNA提取采用商品化的细菌基因组DNA提取试剂盒，按说明书操作。 9.3.2 16S rRNA 基因序列扩增 将上述提取DNA作为模板，利用“4.3”中的引物扩增16S rRNA序列，反应在25μL体系中进行：PCR Premix 12.5μL，上下游引物各1.0μL，2.0μL模板DNA，双蒸水补足至25μL。反应条件：95℃预变性 5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1.5min，循环扩增30次；72℃终延伸10min。4℃保存备用。 空白对照取等体积的双蒸水代替DNA模板。 9.3.3 琼脂糖凝胶电泳 用1×TAE电泳缓冲液配制1%的琼脂糖凝胶（含0.5μL/mLEB）平板，凝固后放入水平电泳槽，使泳 缓冲液刚好淹没胶面。将上述扩增产物6μL样品加入样品孔，使用DNA分子量标准参照物作对照。120V 3 DB51/T 2913—2022 电泳约15～30min，当指示剂到达底部时停止。于紫外光下观察电泳条带，在长波紫外灯下用刀片切下 含有目的条带（约1500bp）的胶块，放入无菌离心管中称重。 9.3.4 PCR 扩增产物纯化 将上述琼脂糖凝胶电泳产物，使用PCR纯化试剂盒进行纯化DNA，按说明书操作。 9.3.5 测序与同源性分析 将上述提取的DNA进行测序，并与参考序列（附录B）进行比对分析。 9.4 特异性检测 9.4.1 特异性基因扩增 将“9.3.1”中提取DNA作为模板，利用“4.4”中的引物扩增，进行特异性PCR检测，同时设置阳性 和阴性对照。反应在25μL体系中进行，反应条件：94℃预变性4min；94℃变性1min，58℃退火30s，72℃ 延伸1.5min，循环扩增30次；72℃终延伸10min。 9.4.2 序列检测 PCR产物于1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，观察