ICS 65.150 CCS B 52 四 DB51 川 省 地 方 标 准 DB51/T 2910—2022 鲟鱼类志贺邻单胞菌病诊断技术规程 Technical specification for the diagnosis of Plesiomonas shigelloides for sturgeon 2022-05-20 发布 2022-07-01 实施 四川省市场监督管理局 发布 DB51/T 2910-2022 目 次 前言 ................................................................................. II 1 范围 ................................................................................. 1 2 规范性引用文件 ...................................................................... 1 3 术语和定义 .......................................................................... 1 4 试剂和材料 .......................................................................... 1 5 设备与器械 .......................................................................... 2 6 临床检查 ............................................................................ 2 7 实验室样品采集 ...................................................................... 2 8 细菌分离与纯化 ...................................................................... 2 9 细菌鉴定 ............................................................................ 2 10 结果判定 ........................................................................... 4 11 综合判定 ........................................................................... 4 附录 A （规范性）试剂配方 ............................................................. 5 附录 B （资料性）类志贺邻单胞菌 16S rRNA 基因参考序列 .................................. 6 I DB51/T 2910-2022 前 言 文件按照 GB/T 1.1—2020 《标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规 定起草。 本文件由四川省农业农村厅提出、归口并解释。 本文件起草单位：四川省农业科学院水产研究所。 本文件主要起草人：刘亚、龚全、赖见生、吴晓雲、陈叶雨、宋明江、杜军、刘光迅、周剑。 本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为： ——本次为首次发布。 II DB51/T 2910—2022 鲟鱼类志贺邻单胞菌病诊断技术规程 1 范围 本文件规定了鲟鱼类志贺邻单胞菌病诊断的术语和定义、试剂和材料、设备和器材、临床检查、实 验室样品采集、细菌分离与纯化、细菌鉴定、结果判定和综合判定等技术规程。 本文件适用于达氏鲟（Acipenser dabryanus）和西伯利亚鲟（Acipenser baerii）的类志贺邻单 胞菌（Plesiomonas shigelloides）的诊断。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 4789.28-2013 食品安全国家标准 食品微生物学检验 培养基和试剂的质量要求 GB/T 6682-2008 分析实验室用水规格和实验方法 GB/T 18652-2002 致病性嗜水气单胞菌检验方法 SC/T 7013-2008 水生动物产地检疫采样技术规范 SC/T 7014-2006 水生动物检疫实验技术规范 SC/T 7201.1-2006 鱼类细菌病检疫技术规程 第 1 部分：通用技术 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 鲟鱼类志贺邻单胞菌病 Plesiomonas shigelloides for sturgeon 指由类志贺邻单胞菌（Plesiomonas shigelloides）感染引起达氏鲟和西伯利亚鲟发病或死亡的一 种细菌性疾病。 4 试剂和材料 4.1 试剂、染色液和培养基 检验中所需试剂、染色液与培养基的配制按照 GB/T 4789.28、GB/T 18652 和 SC/T 7014 规定执 2+ 行，Taq酶、dNTPs、10×PCR缓冲液（无Mg ），DNA分子量标准参照物选用专业试剂公司提供的商品化 试剂；微生物生化鉴定管可替代相应鉴定培养基或鉴定试剂，上述未提及的见附录A。 4.2 水 应符合GB/T 6682中一级水的规格。 4.3 引物 16S rRNA 基 因 DNA 序 列 扩 增 引 物 ， P-F ： 5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' ， P-R ： 5'GGTTACCTTGTTACGACTT -3'，-20 ℃保存。 1 DB51/T 2910—2022 5 设备与器械 超净工作台、高压灭菌锅、恒温培养箱、高速冷冻离心机、水平电泳系统、凝胶成像系统、普通光 学显微镜、PCR扩增仪、电子天平、微量移液器、普通冰箱、解剖盘、剪刀、镊子、手术刀、培养皿、 铂耳丝、酒精灯等。 6 临床检查 6.1 临床症状 病鱼共同特征为反应迟钝，离群独游，游动迟缓或侧翻，摄食减少或停止摄食。 6.2 体表检查 体表外部检查参照 SC/T 7201.1 中 6.2 执行。病鱼鳍条基部不同程度的充血、出血；部分病鱼腹 部膨大；极少病鱼无明显外部病变。 6.3 剖检 肝脏肿大充血，出血；部分病鱼肠道肠腔内有少量淡黄色的粘液，部分病鱼肠道无明显的变化。 7 实验室样品采集 样品采集按 SC/T 7013 执行。 8 细菌分离与纯化 在无菌的环境中，用灭菌铂耳分别勾取病鱼的肝、肾，划线接种至LB固体培养基，28 ℃培育24-48 小时，从中挑取圆形、隆起、光滑、边缘整齐的单个菌落在LB平板上进行纯化培养。LB培养基的配制方 法见附录A.1。 9 细菌鉴定 9.1 革兰氏染色 参考 GB/T 18652-2002 中 2.2.5 规定执行。 9.2 生理生化试验 采用细菌生化鉴定管进行试验，也可利用全自动细菌鉴定仪鉴定。 9.2.1 乙酰甲基甲醇（V-P）试验 按 SC/T 7014 中表 2 的规定执行。有气泡产生为阳性；无气泡产生为阴性。 9.2.2 氧化酶试验 以毛细管吸取四甲基对二苯胺的 1 %水溶液滴在细菌的菌落上。菌落呈玫瑰红色、深紫色为阳性， 不变色为阴性。 2 DB51/T 2910—2022 9.2.3 吲哚试验 按 SC/T 7014 表 2 的吲哚（靛基质）试验的规定执行。培养基变红为阳性；不变红为阴性。 9.2.4 糖、醇类（葡萄糖、甘露醇）发酵试验 将待检菌穿刺接种于糖、醇类发酵试验培养基（A.2），28 ℃培养 24 h后观察。培养基变黄色为 阳性，不变黄色为阴性。 9.2.5 运动性试验 按 GB/T 4789.28 中 2.8 的方法配制半固体培养基。把待检菌穿刺接种于半固体培养基，28 ℃培 养 36 h-48 h。若待检菌由穿刺线向四周扩散，其边缘呈云雾状，为运动性阳性；若待检菌只生长在穿 刺线上，边缘十分清晰，为运动性阴性。 9.3 16S rRNA 基因序列测定与同源性分析 9.3.1 细菌基因组 DNA 抽提 酚氯仿法、高盐法或采用商用试剂盒提取细菌基因组DNA。 9.3.2 16S rRNA 基因扩增 2+ PCR反应体系： 10 ×PCR缓冲液（无Mg ）5.0 μL，MgCl2（25 mmol/L）5.0 μL，dNTPs（10 mmol/L） 1.0 μL，引物(20 μmol/L)P-F和P-R各1.0 μL，Taq DNA酶（5 U/μL）0.5 μL，DNA模板1.0 μL， 无菌双蒸水补足至50 μL。混匀后，3000 r/min离心30s。设空白对照，空白对照取等体积的双蒸水代 替DNA模板。 PCR反应条件：94 ℃预变性 5 min；94 ℃变性 1 min，54 ℃退火 1 min，72 ℃延伸 1 min，35 次循环；72 ℃延伸 10 min；4 ℃保温。 9.3.3 琼脂糖凝胶电泳 用TAE电泳缓冲液（A.3）配制 1 ％的琼脂糖平板，凝固后放入水平电泳槽，使电泳缓冲液刚好淹 没胶面。将上述 6 μL样品和 2 μL溴酚蓝指示剂溶液（A.4）混合后加入样品孔，使用DNA分子量标准 参照物作对照。120 V电泳约 20 min-40 min，当溴酚蓝到达底部时停止。于紫外光下观察，并在长波 紫外灯下用刀片切下含目的条带（约1500 bp）的胶块，放入无菌离心管中称重。 9.3.4 PCR 扩增产物纯化、测序、序列比对 9.3.4.1 PCR 扩增产物纯化 按每 0.1 g 琼脂糖凝胶加 0.1 mL 酚，将酚加入 9.3.3 含有目的条带胶块的离心管中。经漩涡震 荡仪震荡1 min-2 min，将离心管在-70 ℃放置1h，使凝胶完全冻结。37 ℃水浴将冻结的凝胶融化后， 在漩涡震荡仪上震荡 1 min-2 min；14000 r/min 离心 5 min。取上层水相转入另一个离心管中，加入 等体积的酚：氯仿：异戊醇（25﹕24﹕1）（A.5），混匀，12000 r/min 离心 5 min。取上清液加入等 体积的氯仿：异戊醇（24: