ICS 11.220 CCS B 41 DB51 四 川 省 地 方 标 准 DB51/T 2905—2022 猪 A 型塞内卡病毒分离鉴定技术规范 Technical specification for isolation and identification for swine senecavirus A 2022 - 05 - 20 发布 四川省市场监督管理局 2022 - 07 - 01 实施 发 布 DB51/T 2905—2022 目 次 前言 ................................................................................. II 1 范围 ............................................................................... 1 2 规范性引用文件 ..................................................................... 1 3 术语和定义 ......................................................................... 1 4 缩略语 ............................................................................. 1 5 试剂与设备 ......................................................................... 1 5.1 主要试剂 ....................................................................... 1 5.2 主要仪器设备 ................................................................... 2 6 样品的采集、保存与运输 ............................................................. 2 6.1 样品采集 ....................................................................... 2 6.2 保存与运输 ..................................................................... 2 7 病毒的细胞分离培养 ................................................................. 2 7.1 7.2 7.3 7.4 7.5 生物安全措施 ................................................................... 样品的处理 ..................................................................... 单层细胞制备 ................................................................... 样品接种 ....................................................................... 病毒收获 ....................................................................... 2 2 2 3 3 8 病毒核酸鉴定 ....................................................................... 3 8.1 8.2 8.3 8.4 8.5 RT-LAMP 和 RT-PCR 引物 ........................................................... 核酸提取和反转录 ............................................................... RT-LAMP 反应 .................................................................... RT-PCR 反应 ..................................................................... 试验结果观察 ................................................................... 3 3 3 4 4 9 结果判定 ........................................................................... 5 9.1 RT-LAMP ........................................................................ 5 9.2 RT-PCR ......................................................................... 5 9.3 病毒分离鉴定 ................................................................... 5 附录 A（规范性） 试剂配置 ............................................................. 6 附录 B（资料性） 猪 A 型塞内卡病毒 VP1 蛋白基因 LAMP 和 RT-PCR 扩增序列 ................... 7 I DB51/T 2905—2022 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件由四川省农业农村厅提出、归口并解释。 本文件主要起草单位：四川省动物疫病预防控制中心、四川农业大学。 本文件主要起草人：陈弟诗、徐志文、陈斌、朱玲、张毅、裴超信、陈冬、邱明双、梁璐琪、李淳、 翁周、谢伟、邱凌、李波、彭晔、陈岗、魏秋霞、李英林、孙贤刚、彭珂楠、鲁令华。 本文件首次发布。 II DB51/T 2905—2022 猪 A 型塞内卡病毒分离鉴定技术规范 1 范围 本文件规定了猪A型塞内卡病毒分离鉴定方法、RT-LAMP及 RT-PCR诊断方法。 本文件适用于猪A型塞内卡病毒的病原分离和鉴定、实验室诊断、病毒检测、流行病学调查。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和实验方法 GB 19489 实验室生物安全通用要求 NY/T 541 兽医诊断样本采集、保存与运输技术规范 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 CPE：细胞病变 DMEM：细胞营养液 DNA marker：DNA相对分子质量标记 FBS：胎牛血清 HEPES：4-羟乙基哌嗪乙磺酸 PBS：磷酸缓冲液 PK-15：猪肾细胞 RT-LAMP：逆转录环介导等温扩增 RT-PCR：反转录-聚合酶链式反应 SVA：猪A型塞内卡病毒 5 试剂与设备 5.1 主要试剂 5.1.1 所用生化试剂均为分析纯。 5.1.2 实验用水应符合 GB/T 6682 一级水要求或采用超纯水，并经高温灭菌。 5.1.3 PK-15 细胞、DMEM 培养基、胰蛋白酶、HEPES 缓冲液(1mol/L 储存液)、0.01 mol/L pH 7.0~7.4 1 DB51/T 2905—2022 PBS（参见附录 A）；RNA 提取试剂盒、反转录试剂盒、PCR 反应混合液（2×）、LAMP 反应各组分试剂。 5.2 主要仪器设备 微量可调移液器、二氧化碳恒温箱、组织破碎仪、高速离心机、恒温水浴槽或恒温金属浴、PCR仪、 稳压稳流电泳仪和水平电泳槽、凝胶成像仪、倒置生物显微镜。 6 样品的采集、保存与运输 6.1 样品采集 6.1.1 水泡液采集 用一次性注射器吸取临床发病猪只水泡液0.5 mL~1 mL，并将水泡液装入保存管，加青霉素至终浓 度1000 IU/mL、链霉素至终浓度500IU/mL，不能立即使用应置于-70℃冷冻保存； 6.1.2 水泡皮采集 用0.01 mol/L PBS（pH 7.4）清洗水泡表面，然后用灭菌手术剪刀剪取水泡皮2g~5g，装入样品保 存管，加适量50%甘油-PBS保存液，使保存液液面没过样品，不能立即使用应置于-70℃冷冻保存； 6.1.3 其他组织样品采集 若采集不到典型的水泡皮，则采集病灶周围破溃组织或淋巴结、肺脏、扁桃体、肠道等组织5g~10g， 装入样品保存管，加适量50%甘油-PBS保存液，使保存液液面没过样品，加盖封口，不能立即使用即放 于-70℃冷冻保存。 6.2 保存与运输 采集的样品应按照NY/T 541要求包装和运输。 7 病毒的细胞分离培养 7.1 生物安全措施 SVA分离鉴定时，应在高等级生物安全实验室操作，按照GB 19489（所有部分）的规定执行。 7.2 样品的处理 7.2.1 水泡液样品处理 水泡液4 ℃ 3000 r/min离心10min，以0.22μm无菌滤膜过滤除菌后，-70℃保存备用； 7.2.2 水泡皮及其他组织样品处理 取0.5g待检组织样品，加入1mL~1.5mL PBS，用组织破碎仪充分破碎，用含青、链霉素的DMEM作3:1 （V/W）稀释。反复冻融3次后，4 ℃ 3000 r/min离心10min，取上清液，以0.22 μm无菌滤膜过滤除菌 后，转入1.5 mL离心管中，-70 ℃保存备用。 7.3 单层细胞制备 2 DB51/T 2905—2022 按常规方法将PK-15细胞分装在25 cm2细胞培养瓶中，每瓶加入含8% FBS的 DMEM 培养基5mL，细胞 浓