ICS 11.220 CCS B 41 DB42 湖 北 省 地 方 标 准 DB42/T 1864.3—2022 家禽疫病诊断技术规程 第 3 部分：鸡沙门氏菌、产气荚膜梭菌和空 肠弯曲菌三重荧光 PCR 检测方法 Code for practice diagnostic techniques of poultry diseases series—— Part 3: Test method of triple fluorescent PCR for detectingchicken Salmonella, Clostridium perfringens and Campylobacter jejuni 2022-04-25 发布 湖北省市场监督管理局 2022-06-25 实施 发 布 DB42/T 1864.3—2022 目 次 前言 ................................................................................. II 引言 ................................................................................ III 1 范围 ................................................................................ 1 2 规范性引用文件 ...................................................................... 1 3 术语和定义 .......................................................................... 1 4 缩略语 .............................................................................. 1 5 原理 ................................................................................ 2 6 试验条件 ............................................................................ 2 7 仪器设备 ............................................................................ 2 8 试剂或材料 .......................................................................... 2 9 试验步骤 ............................................................................ 3 10 结果判定 ........................................................................... 4 11 生物安全措施 ....................................................................... 4 I DB42/T 1864.3—2022 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件DB42/T 1864《家禽疫病诊断技术规程》为系列标准。 本部分为DB42/T 1864的第3部分。DB42/T 1864发布了以下部分： ——第 1 部分：家禽主要肿瘤病病原鉴别。 ——第 3 部分：鸡沙门氏菌、产气荚膜酸菌和空肠弯曲菌三重荧光 PCR 检测方法。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由湖北省农业科学院畜牧兽医研究所提出。 本文件由湖北省农业农村厅归口管理。 本文件起草单位：湖北省农业科学院畜牧兽医研究所、湖北省动物疫病预防控制中心。 本文件主要起草人：张腾飞、罗青平、邵华斌、李婷婷、彭伏虎、温国元、王红琳、汪宏才、张蓉 蓉、卢琴、罗玲、张文婷、商雨。 本 文 件 实 施 应 用 的 疑 问 ， 可 咨 询 湖 北 省 农 业 农 村 厅 ， 联 系 电 话 ： 027-87665821 ， 邮 箱 ： [email protected]；在执行过程中有意见和建议请及时反馈至湖北省农业科学院畜牧兽医研究所，联系 电话：027-87284950，邮箱：[email protected]。 II DB42/T 1864.3—2022 引 言 近年来，我国高度重视动物传染病的预防和控制工作，在国务院颁布的《国家中长期动物疫病防治 规划（2012～2020年）》中明确要求进一步做好种禽场疫病净化、加强疫病检测诊断能力建设。家禽及 蛋制品产业链是湖北省的十大重点产业链之一，为了加快湖北省重点农业产业链建设，保证家禽养殖健 康与食品安全，依据《湖北省重点农业产业链实施方案》，对影响家禽及蛋制品产业链的禽白血病、禽 致病性大肠杆菌、沙门氏菌等家禽重要疫病开展快速检测方法研究。为加快我省家禽疫病净化进程，提 升疫病的监测、检测效率，促进我省家禽业持续健康发展，起草组围绕家禽疫病防控的需要，研制了《家 禽疫病诊断技术规程》系列标准，拟由4个部分构成。 ——第一部分：家禽主要肿瘤病病原鉴别。目的在于开展家禽 J 亚群白血病病毒、马立克氏病病 毒、网状内皮组织增生症病毒的快速检测，指导家禽肿瘤病的快速鉴别诊断。 ——第二部分：禽大肠杆菌致病群双重探针法检测。目的在于检测家禽泄殖腔拭子和粪便中的致 病群大肠杆菌，指导家禽致病群大肠杆菌的快速检测。 ——第三部分：鸡沙门氏菌、产气荚膜梭菌和空肠弯曲菌三重荧光 PCR 检测方法。目的在于检测 鸡肉及相关产品、鸡泄殖腔拭子和粪便中的沙门氏菌、产气荚膜梭菌和空肠弯曲菌，指导鸡 肉及相关产品细菌性疾病的快速检测。 ——第四部分：禽白血病抗原 ELISA 检测方法。目的在于检测种鸡群蛋清、血浆、精液、胎粪、 肛拭子中禽白血病抗原 ELISA 检测，指导种鸡场禽白血病的净化检测。 III DB42/T 1864.3—2022 家禽疫病诊断技术规程 第 3 部分：鸡沙门氏菌、产气荚膜梭菌和空肠弯曲菌三重荧光 PCR 检测方法 1 范围 本文件规定了禽沙门氏菌、产气荚膜梭菌和空肠弯曲菌三重荧光PCR检测方法所需检测样品、仪器 与设备、试剂与材料、检测步骤及结果判定。 本文件适用于检测鸡肉及相关产品、鸡泄殖腔拭子和粪便中的沙门氏菌、产气荚膜梭菌和空肠弯曲 菌。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 4789.17 食品卫生微生物学检验肉与肉制品检验 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室生物安全通用要求 GB/T 27403 实验室质量控制规范食品分子生物学检测 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 荧光PCR realtime PCR 一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 BHQ1：黑洞淬灭剂-1（Black Hole Quencher-1） BHQ2：黑洞淬灭剂-2 （Black Hole Quencher-2） Ct值：循环阈值（Cycle threshold） DNA：脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleic Acid） dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate） FAM：荧光素酰胺（Fluorescein Amidite） HEX：六氯荧光素（Hexachloro-Fluorescein） 1 DB42/T 1864.3—2022 PCR：聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction） TAMRA：羧四甲基罗丹明（Carboxytetramethylrhodamine） Taq酶：Taq DNA聚合酶（Taq DNA polymerase） 5 原理 本文件采用Taqman三重探针法对鸡沙门氏菌、产气荚膜梭菌和空肠弯曲菌进行检测。该方法的原理 是：针对沙门氏菌的特异性基因invA、产气荚膜梭菌的特异性基因cpa、空肠弯曲菌的特异性基因ccoN， 分别设计特异的引物和探针，并以三种不同荧光标记三条探针，建立了一种鸡沙门氏菌、产气荚膜梭菌 和空肠弯曲菌三重荧光PCR检测方法。在样品检测时，样品DNA经PCR扩增与探针杂交，根据对应荧光强 度判断是否存在鸡沙门氏菌、产气荚膜梭菌或空肠弯曲菌。 6 试验条件 实验操作应在室温（18℃～25℃）下进行。样品前处理应在二级生物安全柜中进行。 7 仪器设备 7.1 7.2 7.3 7.4 7.5 实时荧光 PCR 仪。 生物安全柜。 台式冷冻小型离心机（转速≥12 000 r/min）。 微量移液器（2.5 μL、10 μL、200 μL、1 mL）。 冷藏冷冻冰箱。 8 试剂或材料 8.1 试剂配制 本方法试验用水应按照GB/T 6682中规定的二级水，所有实验用试剂均为分析纯。试剂配制按照GB/T 27403规定执行。 8.2 试剂或材料 8.2.1 PCR 缓冲液，dNTPs，Taq 酶。 8.2.2 商品化的细菌基因组 DNA 提取试剂盒。 8.2.3 沙 门 氏 菌 引 物 与 探 针 ： 上 游 引 物 5’-GCTGCTTTCTCTACTTAACAGTGC-3’ ， 下 游 引 物 5’-CCAGTACGATATTCAGTGCGATC-3’，探针 5’-TAMRA-TCGTTTACGACCTGAATTACTGATTCTGGTAC-BHQ2-3’。 8.2.4 产 气 荚 膜 梭 菌 引 物 与 探 针 ： 上 游 引 物 5’-TGTAAGGCGCTTATTTGTGCT-3’ ， 下 游 引 物 5’-CCCTTGAGTTACAATCATAGCATG-3’，探针 5’-FAM-ACGCTAGCAACTAGCCTATGGGCTGG-BHQ