ICS 11.220 CCS B 41 DB42 湖 北 省 地 方 标 准 DB42/T 1864.2—2022 家禽疫病诊断技术规程 第 2 部分：禽大肠杆菌致病群双重探针法检 测 Code for practice diagnostic techniques of poultry diseases series—— Part 2: Testmethodof dual probe PCR for detecting pathogenic Escherichia coli 2022-05-26 发布 湖北省市场监督管理局 2022-07-26 实施 发 布 DB42/T 1864.2—2022 目 次 前言 ................................................................................. II 引言 ................................................................................. IV 1 范围 ................................................................................ 1 2 规范性引用文件 ...................................................................... 1 3 术语和定义 .......................................................................... 1 4 缩略语 .............................................................................. 1 5 原理 ................................................................................ 1 6 试验条件 ............................................................................ 2 7 仪器设备 ............................................................................ 2 8 试剂或材料 .......................................................................... 2 9 试验步骤 ............................................................................ 3 10 结果判定 ........................................................................... 4 11 生物安全措施 ....................................................................... 4 I DB42/T 1864.2—2022 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件DB42/T 1864《家禽疫病诊断技术规程》为系列标准。 本部分为DB42/T 1864的第2部分。DB42/T 1864发布了以下部分： ——第 1 部分：家禽主要肿瘤病病原鉴别。 ——第 2 部分：禽大肠杆菌致病群双重探针法检测 ——第 3 部分：鸡沙门氏菌、产气荚膜酸菌和空肠弯曲菌三重荧光 PCR 检测方法。 ——第 4 部分：禽白血病抗原 ELISA 检测方法。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由湖北省农业科学院畜牧兽医研究所提出。 本文件由湖北省农业农村厅归口管理。 本文件起草单位：湖北省农业科学院畜牧兽医研究所、湖北省动物疫病预防控制中心。 本文件主要起草人：张文婷、罗青平、邵华斌、周艳君、金鑫、张腾飞、温国元、王红琳、商雨、 汪宏才、张蓉蓉、卢琴、罗玲。 本 文 件 实 施 应 用 的 疑 问 ， 可 咨 询 湖 北 省 农 业 农 村 厅 ， 联 系 电 话 ： 027-87665821 ， 邮 箱 ： [email protected]；在执行过程中有意见和建议请反馈至湖北省农业科学院畜牧兽医研究所，联系电话： 027-87284950，邮箱：[email protected] II DB42/T 1864.2—2022 III DB42/T 1864.2—2022 引 言 近年来，我国高度重视动物传染病的预防和控制工作，在国务院颁布的《国家中长期动物疫病防治 规划（2012～2020年）》中明确要求进一步做好种禽场疫病净化、加强疫病检测诊断能力建设。家禽及 蛋制品产业链是湖北省的十大重点产业链之一，为了加快湖北省重点农业产业链建设，保证家禽养殖健 康与食品安全，依据《湖北省重点农业产业链实施方案》，对影响家禽及蛋制品产业链的禽白血病、禽 致病性大肠杆菌、沙门氏菌等家禽重要疫病开展快速检测方法研究。为加快我省家禽疫病净化进程，提 升疫病的监测、检测效率，促进我省家禽业持续健康发展，起草组围绕家禽疫病防控的需要，研制了《家 禽疫病诊断技术规程》系列标准，拟由4个部分构成。 ——第一部分：家禽主要肿瘤病病原鉴别。目的在于开展家禽 J 亚群白血病病毒、马立克氏病病毒、 网状内皮组织增生症病毒的快速检测，指导家禽肿瘤病的快速鉴别诊断。 ——第二部分：禽大肠杆菌致病群双重探针法检测。目的在于检测家禽泄殖腔拭子和粪便中的致 病群大肠杆菌，指导家禽致病群大肠杆菌的快速检测。 ——第三部分：鸡沙门氏菌、产气荚膜梭菌和空肠弯曲菌三重荧光 PCR 检测方法。目的在于检测 鸡肉及相关产品、鸡泄殖腔拭子和粪便中的沙门氏菌、产气荚膜梭菌和空肠弯曲菌，指导鸡 肉及相关产品细菌性疾病的快速检测。 ——第四部分：禽白血病抗原 ELISA 检测方法。目的在于检测种鸡群蛋清、血浆、精液、胎粪、 肛拭子中禽白血病抗原 ELISA 检测，指导种鸡场禽白血病的净化检测。 IV DB42/T 1864.2—2022 家禽疫病诊断技术规程 第 2 部分：禽大肠杆菌致病群双重探针法检测 1 范围 本文件规定了禽致病群大肠杆菌双重探针检测方法所需检测仪器、试剂、样品、检测步骤及结果判 定。 本文件适用于检测家禽泄殖腔拭子和粪便中的致病群大肠杆菌。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室生物安全通用要求 GB/T 27403 实验室质量控制规范食品分子生物学检测 NY/T 555 动物产品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌的检测方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 大肠杆菌致病群 escherichia coli phylogenetic group 根据系统进化分类，将大肠杆菌分为B2、D、B1和A群，其中B2群和D群大肠杆菌称为致病群大肠杆 菌。 3.2 荧光PCR realtime PCR 一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 BHQ1：黑洞淬灭剂-l（Black Hole Quencher-1） Ct值：循环阈值（Cycle threshold） FAM：荧光素酰胺（Fluorescein Amidite） HEX：六氯荧光素（Hexachloro- Fluorescein） 5 原理 1 DB42/T 1864.2—2022 本文件采用Taqman双重探针法对家禽大肠杆菌中的致病群进行筛选。该方法的原理是：种系发生分 群是大肠杆菌分子流行病学的重要特征，依据chuA基因、yiaA基因和DNA片段TspE4. C2的有无，大肠杆 菌可被分为B2、D、B1和A四个种群（表1）。流行病学资料显示，B2群和D群为主要的致病群。针对禽源 大肠杆菌毒力岛基因chuA和yiaA，设计特异的引物和荧光探针，建立了一种禽大肠杆菌致病群筛选的 Taqman双重探针检测方法，根据对应的荧光曲线反应和Ct值来判断禽大肠杆菌的致病群。 表1 大肠杆菌种群的判定 种群 chuA yiaA TspE4. C2 B2 ＋ ＋ / D ＋ － / B1 － / ＋ A － / － 注：“＋”表示该基因检测为阳性，“－”表示该基因检测为阳性，“/” 表示不检测该基因。 6 试验条件 实验操作应在室温（18℃～25℃）下进行。样品前处理及菌株分离鉴定应在二级生物安全柜中进行。 7 仪器设备 7.1 7.2 7.3 7.4 7.5 7.6 荧光定量 PCR 仪。 二级生物安全柜。 涡旋震荡器。 微量移液器（规格为 1 mL、100 μL、50 μL 和 2.5 μL）。 恒温培养箱：36℃±1℃。 台式冷冻小型离心机（转速≥12 000 r/min）。 8 试剂或材料 8.1 试剂配制 本方法试验用水应按照GB/T 6682中规定的二级水，所有实验用试剂均为分析纯。试剂配制按照GB/T 27403规定实施。 8.2 试剂或材料 8.2.1 Cary-Blair 运送培养基。 8.2.2 荧光定量 PCR 探针预混物。 8.2.3 商品化的细菌基因组 DNA 提取试剂盒。 8.2.4 chuA 基 因 引 物 与 探 针 ： 上 游 引 物 5’-CTGGGTGGAGTGATCTCCTA-3’ ， 下 游 引 物 ： 5’-TGCCGCCAGTACCAAAG-3’，探针：5’-FAM-TTGCAGGAAGGACAAAGCAGTGGT-BHQ1-3’。 8.2.5 yjaA 基 因 引 物 与 探 针 ： 上 游 引 物 5’-GAAAGCAAACGTGAAGTGTCAG-3’ ， 下 游 引 物 ： 2 DB42/T 1864.2—2022 5’-GGTGGAGTTGCAGAACAAGA-3