ICS 65.020.30 CCS B 43 41 河 南 省 地 方 标 准 DB41/T 2273—2022 肉牛快速扩繁技术规程 2022-06-29 发布 2022-09-28 实施 河南省市场监督管理局 发 布 DB41/T 2273—2022 目 次 前言 ................................................................................. II 1 范围 ............................................................................... 1 2 规范性引用文件 ..................................................................... 1 3 术语和定义 ......................................................................... 1 4 同期发情和人工授精 ................................................................. 1 5 胚胎生产与移植 ..................................................................... 2 6 妊娠牛饲养管理 ..................................................................... 5 附录 A（资料性） 供体牛信息记录表及胚胎冷冻记录表样式 ................................. 6 附录 B（资料性） 早期胚胎发育形态图 ................................................... 7 附录 C（资料性） 受体牛胚胎移植记录表 ................................................. 8 I DB41/T 2273—2022 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件由河南省农业农村厅提出并归口。 本文件起草单位：河南省畜牧总站、河南省农业科学院畜牧兽医研究所。 本文件主要起草人：张子敬、刘贤、吕世杰、王二耀、茹宝瑞、李志明、王李辉、吴胜军、蔡雯雯、 施巧婷、郎利敏、黄辉、夏宗军、丁涵、徐美芳、赵杨杨、马超峰、辛晓玲、于翔、王献伟、马文涛、 李静、王培育、朱肖亭、楚秋霞、付泰、王欧阳、余亚飞、李惠、刘艳丽、蔡顺姬、余洪涛、周应海、 黄永震、徐照学。 II DB41/T 2273—2022 肉牛快速扩繁技术规程 1 范围 本文件规定了肉牛快速扩繁中同期发情、超数排卵、胚胎移植等要求和方法。 本文件适用于规模化肉牛养殖的快速扩繁。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 4143 牛冷冻精液 NY/T 1335 牛人工授精技术规程 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 供体牛 提供胚胎的母牛。 3.2 受体牛 接受胚胎的母牛。 3.3 同期发情 利用外源激素控制并调整母牛群体发情周期进程，使其在规定时间内集中发情。 3.4 超数排卵 利用外源激素诱发母牛卵巢多个卵泡发育，并同时排出多个具有受精能力的卵子。 3.5 人工授精 借助专门器械将公牛精液输入发情母牛的生殖道内使其受孕的过程。 3.6 胚胎移植 将供体牛体内或其它方式获得的早期胚胎，移植到对应生殖周期的受体牛体内，使之继续发育的生 物技术。 4 同期发情和人工授精 1 DB41/T 2273—2022 4.1 同期发情方法 4.1.1 二次前列腺素（PG）法 适配母牛任选一天肌肉注射PG，9 d～13 d进行第二次注射，24 h～72 h观察发情。 4.1.2 黄体酮缓释阴道栓法 适配母牛任选一天放入黄体酮缓释阴道栓，5 d～7 d 撤栓并注射 PG，24 h～72 h 观察发情。 4.2 人工授精 冷冻精液应符合GB/T 4143的要求。人工授精操作按照NY/T 1335的规定。 5 胚胎生产与移植 5.1 供体牛选择与饲养管理 5.1.1 供体牛选择 品种优良，系谱清晰，体型外貌和生产性能评级一级以上，生殖器官正常，无繁殖障碍疾病。年龄 15月龄至8周岁。青年牛应为15月龄～18月龄，体况中上等且至少有两次正常发情记录；经产牛应为产 后60 d以上，有两次正常发情记录且子宫恢复正常。确定为供体牛前应进行检疫，有传染性疾病的母牛 不能作为供体。 5.1.2 供体牛饲养管理 保持饲养环境良好，避免应激反应。提供合理的配合日粮和清洁饮水。超数排卵前3周加强饲养管 理，补充维生素和微量元素，保持中等以上膘情。 5.2 供体牛超数排卵及人工授精 5.2.1 超数排卵 5.2.1.1 同期发情方法 准备工作完成后，同期发情方法按照 4.1 的规定。 5.2.1.2 超数排卵方法 以母牛发情当天为0 d，第9 d～13 d中的任意一天开始，每天早（7:00～8:00）和晚（19:00～20:00） 各注射1次促卵泡素（FSH），连续4 d递减注射。注射FSH期间第3 d晚和第4 d早同时注射0.4 mg～0.6 mgPG。 超数排卵药品使用根据不同生产厂家的推荐量结合体重稍作调整。 5.2.1.3 供体牛发情鉴定 最后一次注射FSH后，每隔6 h观察是否发情，每次观察不少于30 min。以母牛被跨稳定作为发情标 准，准确记录时间。 5.2.2 人工授精 精液剂量加倍，按照4.1.2规定操作，间隔12 h重复操作一次。 5.3 非手术冲胚及胚胎质量鉴定 2 DB41/T 2273—2022 5.3.1 冲胚步骤 5.3.1.1 供体牛人工授精后 6 d～7 d 冲胚。冲胚前，所用仪器、器皿等应经过严格的消毒灭菌处理。 冲胚管应检查气囊是否漏气。 5.3.1.2 将供体牛保定，清除粪便，在荐椎和第一尾椎结合处或第一尾椎和第二尾椎结合处注射普鲁 卡因实行硬膜外麻醉，直至尾巴松弛柔软无张力。普鲁卡因用量依据说明书。 5.3.1.3 麻醉后将牛尾固定，清洁会阴部及外阴，酒精棉球或喷雾消毒外阴，用灭菌卫生纸擦干。 5.3.1.4 用扩张棒扩张子宫颈，再用黏液棒抽出黏液。 5.3.1.5 此时直肠易进空气形成空洞，使用抽气筒排出空气，利于直肠把握。 5.3.1.6 冲胚管装配内芯，并用冲胚液润滑，慢慢插入一侧子宫角，当冲胚管到达子宫角大弯处，旋 开内芯旋钮，拔出内芯 5 cm 左右，握紧内芯和冲胚管并向前推进，使内芯再次到达子宫角大弯处。重 复内芯拔出和一体前进 1～3 次。给冲胚管气囊充气 5 mL 确定冲胚管到达子宫角前端。冲胚液可用杜氏 磷酸盐缓冲液（D-PBS）或商用冲胚液。 5.3.1.7 给冲胚管气囊充气约 8 mL～14 mL，抽出内芯，把三通管与冲胚管连接，连上集卵滤皿。 5.3.1.8 夹住三通管的回流端，将 20 mL～30 mL 冲胚液通过注入端注入子宫角。夹住注入端，松开回 流端使子宫角液体回流到集卵滤皿。 重复几次， 每次增加冲胚液 5 mL～10 mL， 每个子宫角总用量 400 mL～ 500 mL。 5.3.1.9 完成后排出气囊空气，另一侧子宫进行相同操作。抽出冲胚管，使前端位于子宫体，灌注抗 生素，肌注 PG，做好采胚记录（见表 A.1）。 5.3.2 胚胎质量鉴定 5.3.2.1 搜集胚胎 集卵滤皿放在 40～100 倍体视显微镜下，逐格检查，捡出的胚胎用培养液清洗 3 次，放入盖有矿物 油的培养液中 35 ℃～37 ℃暂存，捡胚完成后进行等级鉴定。培养液可用 10%牛血清 M199 或其它商用 培养液。 5.3.2.2 胚胎发育期 此时胚胎处于以下发育期：桑椹胚(M)、致密桑椹胚(CM)、囊胚(B)、扩张囊胚(EXB)。胚胎发育形 态图见附录B。 5.3.2.3 胚胎质量等级鉴定 根据胚胎形态将胚胎依次分为 A、B、C、D 四级。 A 级：优秀胚。胚胎整体边缘轮廓清晰，透明带完整光滑，立体结构明显，实质均匀，透明度适中， 碎片量少于 10%或者没有，胚胎的发育阶段与预期的发育阶段一致。 B 级：良好胚。胚胎整体边缘轮廓清晰，立体结构明显，碎片小于 20%，透明度稍暗或稍浅。 C 级：一般胚。轮廓不清晰，透明度过暗或过淡，碎片化超过 30%～40%。 D 级：不可用胚。未受精的卵子、16 细胞以下和碎片化率 50%以上的受精卵。 5.4 胚胎冷冻保存及解冻 5.4.1 胚胎冷冻与保存 5.4.1.1 胚胎清洗 A 级、B 级胚胎在保持液中清洗 4～6 次。保持液使用商用保持液。 3 DB41/T 2273—2022 5.4.1.2 胚胎平衡 胚胎用冷冻液清洗 4～6 次，室温下平衡 5 min。冷冻液使用乙二醇商用冷冻液。 5.4.1.3 胚胎装管 将平衡后的胚胎装入 0.25 mL 细管，装管顺序见图 1。 标引序号说明： 1——棉栓； 2——保持液； 3——空气； 4——冷冻液； 5——含有胚胎的冷冻液； 6——封口。 图1 胚胎装管图 装管后做好胚胎情况标记，内容包括：生产日期、母牛号、公牛号、数量、发育期、质量。 示例：1 枚 A 级桑椹胚标记为 1 MA，其中“1”表示数量，M 表示发育期，“A”表示质量。 5.4.1.4 胚胎冷冻 冷冻仪降温至-6 ℃，放入装有胚胎的细管平衡 5 min，用液氮冷冻后的镊子轻触细管植冰，继续平 衡 5 min，以 0.6 ℃/min 的速率下降至-35℃，平衡 5 min 后投入液氮，记录冷冻情况（见表 A.2）。 5.4.2 胚胎解冻 取出装有胚胎的细管，空气中停留 5 s～10 s 后，迅速放入 35 ℃～37 ℃水浴 45 s。擦干细管， 拔出细管塞，装入移植枪并移植。 5.5 受体牛选择及饲养管理 5.5.1 受体牛选择 骨盆较宽，体型匀称，体高 130 cm 以上，乳房发育良好，性情温顺，营养良好，中等膘情。青年 牛体重达到成年母牛体重的 75%；经产牛 3 胎以下，应有两个以上连续的正常发情周期，泌乳性能、产 犊性能良好，无连续两次人工授精未孕记录。牛体健康，子宫弹性、厚薄正常，卵巢发育正常。 5.5.2 受体牛饲养管理